"Bioluminiscente 'reportero fagos para la detección de patógenos bacterianos de la categoría A

Resumen

Un método simple para la identificación de los patógenos bacterianos prioridad es el uso de fagos reportero de la ingeniería genética. Estos fagos reportero, que son específicos de su especie huésped particular, son capaces de transducir una respuesta rápida de la señal bioluminiscente a las células huésped. En este documento, se describe el uso de fagos reportero para la detección de Yersinia pestis.

Resumen

Yersinia pestis y Bacillus anthracis son de categoría A patógenos bacterianos que son los agentes causales de la peste y el ántrax, respectivamente ^1. A pesar de la presencia natural de ambas enfermedades es ahora relativamente rara, la posibilidad de que grupos terroristas que utilizan estos agentes patógenos como un arma biológica es real. Debido a la comunicabilidad inherente de la enfermedad, curso clínico rápido y alta tasa de mortalidad, es fundamental que un brote se detectó rápidamente. Por lo tanto, las metodologías que proporcionan una rápida detección y el diagnóstico son esenciales para garantizar la aplicación inmediata de medidas de salud pública y la activación de la gestión de crisis.

Recombinante fago reportero puede ofrecer un enfoque rápido y específico para la detección de Y. pestis y B. anthracis. Los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades en la actualidad el uso de los ensayos de fagos lisis clásico para la identificación confirmado de estas bacterias patógenas ^2-4. Estos ensayos de aprovechar de forma natural fagos que son específicos y lítico para sus huéspedes bacterianos. Después de un crecimiento durante la noche de la bacteria cultivada en la presencia de los fagos específicos, la formación de placas (lisis bacteriana) proporciona una identificación positiva de la diana bacteriana. A pesar de estas pruebas son sólidas, sufren de tres problemas: 1) son de laboratorio basado, 2) que requieren aislamiento bacteriano y el cultivo de la muestra sospechosa, y 3) tomar 24-36 horas para completar. Para abordar estas cuestiones, un recombinante de "luz-con etiqueta" fago reportero fueron genéticamente manipulados mediante la integración de los Vibrio harveyi luxAB genes en el genoma de la Y. pestis y B. anthracis específicos fago ^5-8. El fago reportero luxAB resultantes fueron capaces de detectar su objetivo específico de acuerdo rápidamente (en minutos) y la sensibilidad que confiere un fenotipo bioluminiscente a las células receptoras. Es importante destacar que la detección se obtuvo, ya sea con las células receptoras cultivadas o con modelo de infectados muestras clínicas ^7.

Para fines de demostración, aquí se describe el método para la detección de fagos mediada de un conocido Y. pestis aislar utilizando un fago reportero luxAB construido a partir de los CDC plaga de diagnóstico fago ΦA1122 ^6,7 (Figura 1). Un método similar, con ligeras modificaciones (por ejemplo, cambio en la temperatura de crecimiento y los medios de comunicación), se puede utilizar para la detección de B. anthracis aislamientos de la B. fago reportero anthracis Wβ:: luxAB ^8. Este método describe la transducción mediada por fagos de un fenotipo de biolumescent cultivada Y. pestis células que posteriormente se midió utilizando un luminómetro de microplacas. Las principales ventajas de este método en los ensayos de lisis del fago tradicionales es la facilidad de uso, los resultados rápidos, y la capacidad para analizar muestras de forma simultánea en un formato de microtitulación de 96 pocillos.

Figura 1. Esquema de detección. El fago se mezclan con la muestra, el fago infecta a la célula, luxAB expresadas, y el bioluminesces celular. Procesamiento de las muestras no es necesario, el fago y las células se mezclan y posteriormente se valoran por la luz.

Protocolo

1. Y. pestis inoculación placa

1. Racha de Y. pestis A1122 (BeiResources # NR15) los cultivos de acciones en Luria-Bertani (LB) agar (Miller). Una técnica estéril y realizar todas las Y. pestis manipulaciones en un tipo de clase II Un gabinete de bioseguridad. Y. pestis A1122 es un nivel de bioseguridad (BSL) 2 cepa excluidos agente de selección. Se carece de los 75 kb par bajo contenido de calcio de respuesta (LCR) plásmido de virulencia, y el locus PGM que se requieren para la virulencia. Crecer Y. pestis a 28 ° C durante 48 horas a una temperatura controlada de aire estático incubadora. La tasa de creci....

Discusión

Este método demuestra la capacidad del fago reportero para detectar rápidamente Y. pestis desde el fago reportero puede transducir una señal de respuesta bioluminiscente de cultivo Y. pestis células dentro de los 20 minutos después de la adición del fago. El fago reportero también es capaz de detectar directamente Y. pestis en las matrices de clínica, sin el requisito de aislamiento y posterior cultivo ^7. En comparación con los ensayos de lisis del fago estándar que generalmente req.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
Difco agar LB, Miller	VWR	90003-346
LB caldo Difco, Miller	VWR	90003-350
17 x 100 mm tubos de la cultura	EE.UU. Científico	1485-0810
n-Decanal	Sigma	D7384
Microplaca Veritas luminómetro	Turner Biosystems	9100-001
Microlite microtitulación de 96 pocillos	VWR	62402-984