Yabani Kuşlar Kuş Gribi Virüsü Hızlı Teşhis: Alanında Taşınabilir RRT-PCR ve Dondurulmuş kuru Reaktifler Kullanımı
Summary
Bu çalışmada, taşınabilir bir RRT-PCR sistemi kullanarak vahşi kuşlarda kuş gribi teşhisi açıklamaktadır. Bu yöntem, bir salgın senaryosunun tipik olmayan bir laboratuar ortamında yabani kuşlar, ekrana dondurularak kurutulmuş reaktifler yararlanır. Moleküler araçlarını kullanın, hızlı tanı için doğru ve hassas alternatifler sunuyor.
Abstract
Yabani kuşlar, göç flyways boyunca gözetim isteyen, yüksek derecede patojen H5N1 alt tipi Avian influenza (HPAI) yayılmasını suçlanmıştır. Örnekleme kuş gribi virüsü yabani kuşlar (AIV) genellikle uzak bölgelerde yapılan, ancak sonuçlar genellikle moleküler testler için donanımlı bir laboratuvar numune taşıma ihtiyacı nedeniyle ertelendi. Gerçek zamanlı ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RRT-PCR), moleküler tekniği AIV tanısı için en doğru ve hassas yöntemlerden birini sunmaktadır. RRT-PCR için gerekli olan, daha önce sıkı laboratuvar protokolleri alan için adapte ediliyor. Islak reaktiflerin düzeyde hassasiyet ile, soğuk zincir gerekmez dondurularak kurutulmuş (liyofilize) reaktifler Geliştirme yerinde pratik bir hedefi uzaktan test getirdi.
Burada liyofilize reaktifler istihdam RRT-PCR ünitesi (İleri Patojen Kimlik Sağlamlaştırılmış Cihaz veya RAPID, Idaho Teknolojileri, Salt Lake City, UT) (İnfluenza A Hedef 1 Taqman kullanarak yabani kuşlar AIV hızlı tanı için bir yöntem mevcut; ASAY -ASY-0109, Idaho Teknolojileri). Reaktifler tek bir tüp içinde uygun konsantrasyonlarda test etmek için tüm gerekli bileşenleri içerir: astarlar, sondalar, enzimler, tamponlar ve iç pozitif kontrol, yanlış depolama veya ıslak reaktiflerin kullanım ile ilgili hataları ortadan kaldırır. Taşınabilir ünite İnfluenza A matrisi gen ve 2-3 saat verim sonuçları hedefleyen bir ekran yapar. Genetik alt tipleme H5 ve H7 astar ile de bu hedef hemaglutinin gen belirler.
Sistemi göçmen shorebird türleri burada gösterildiği gibi, yabani kuşlar toplanan kloakal ve orofaringeal örnekler, Kuzey Kaliforniya yakalanan batı Sandpiper (Calidrus mauri). Için uygundur. Hayvan kullanımı, US Geological Survey Batı Ekolojik Araştırmalar Merkezi ve US Geological Survey Kuş Laboratuvar Bantlama izin Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokol izledi. Bu tekniğin en önemli avantajı, uzak bir yerde bir salgın içeren şansı artan, yabani kuşların tanıyı hızlandırmak için. On-site Tanı yabani popülasyonları enfekte bireylerin belirlenmesi ve eğitimi için de faydalı olacaktır. Ev sahibi biyoloji (enfeksiyon immünolojik ve fizyolojik tepki) ve mekansal ekoloji (enfekte kuşların göç performans) hakkında bilgi toplamak için fırsat yabani kuşların uzun mesafelerde AIV için vektörler olarak hareket edebilir ölçüde içgörüler sağlayacaktır.
Protocol
Discussion
Burada sunulan hızlı tanı yöntemi AIV gözetim yabani kuş örnekleri zaman verimli ve doğru test kolaylaştırır. , Taşınabilir RRT-PCR daha az katı numune depolama gereksinimleri, sıvı azot nakliyatçılar veya kuru buz mevcut değilse, bir soğuk zincir bakım pratik olabilir uzaktan durumlar için uygundur. Buna ek olarak, alan biyologlar tarafından en az bilgiye sahip laboratuar tabanlı moleküler analiz yapılacak kadar basit oldu dondurularak kurutulmuş reaktifleri ile bu numune analizi bulundu. Bu …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz, teknik destek ve finansman (S. Schwarzbach) ve yardım (K. Spragens, T. Graham) USGS Batı Ekolojik Araştırma Merkezi, M. Scullion ve R. Idaho Teknolojileri Crisp teşekkür etmek istiyoruz. Enstitüsü, Savunma ve Hava Kuvvetleri Araştırma Laboratuvarı Anabilim Dalı destek Savunma ve İç Güvenlik (www.idhs.org) – Bu araştırma, Yenilikçi Teknoloji Merkezi himayesinde yapıldı. Hayvan kullanımı, US Geological Survey Batı Ekolojik Araştırmalar Merkezi ve US Geological Survey Kuş Laboratuvar Bantlama izin Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokol izledi. Bu yayında, ticaret, ürün, veya firma isimleri, her türlü kullanımı sadece tanımlayıcı amaçlar için ve ABD hükümeti tarafından onaylandığı anlamına gelmez.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| RNeasy mini spin column | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Collection tubes (1.5 & 2 mL) | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RLT | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RW1 | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RPE | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| RNase-free water | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| 14.3 M β-mercaptoethanol solution | Fisher Scientific | BP176100 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2, 120V | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Taqman Influenza A Target 1 (Hydrolysis Probe) | Idaho Technologies | ASAY-ASY-0109 | |
| Lightcycler 20ml capillary tubes | Roche Applied Science | 04929292001 | |
| Micro-centrifuge with rotator for 2 ml tubes | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device (RAPID) 7200 | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Pentium-based laptop with Windows XP Professional | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Lightcycler Data Analysis software | Idaho Technologies | Included in RAPID kit |
Referencias
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Takekawa, J. Y. Field detection of avian influenza virus in wild birds: evaluation of a portable rRT-PCR system and freeze-dried reagents. J Virol Methods. 166, 92-97 (2010).
- Das, A., Spackman, E., Senne, D., Pedersen, J., Suarez, D. L. Development of an internal positive control for rapid diagnosis of avian influenza virus infections by real-time reverse transcription-PCR with lyophilized reagents. J Clin Microbiol. 44, 3065-3073 (2006).
- Spackman, E., Suarez, D. L. Avian influenza virus RNA extraction from tissue and swab material. Methods Mol Biol. 436, 13-18 (2008).
- Chen, R., Holmes, E. C. Frequent inter-species transmission and geographic subdivision in avian influenza viruses from wild birds. Virology. , 383-3156 (2009).
- Macken, C. A., Webby, R. J., Bruno, W. J. Genotype turnover by reassortment of replication complex genes from avian influenza A virus. J Gen Virol. 87, 2803-2815 (2006).
- Dugan, V. G. The evolutionary genetics and emergence of avian influenza viruses in wild birds. PLoS Pathog.. 4, e1000076-e1000076 (2008).
- Spackman, E. Phylogenetic analyses of type A influenza genes in natural reservoir species in North America reveals genetic variation. Virus Res. 114, 89-100 (2005).
- Pasick, J. Advances in the molecular based techniques for the diagnosis and characterization of avian influenza virus infections.. Transbound Emerg Dis. 55, 329-338 (2008).
- . OIE Manual of diagnostics tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and bees). 1, 258-269 (2004).
- Weber, T. P., Stilianakis, N. I. Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds. Emerg. Infect. Dis. 13, 1139-1143 (2007).
- Kim, J. -. K., Negovetich, N. J., Forrest, H. L., Webster, R. G. Ducks: the “Trojan Horses” of H5N1 influenza. Influenza and Other Respiratory Viruses. , 121-128 (2009).
- Gilbert, M. Flying over an infected landscape: distribution of highly pathogenic avian influenza H5N1 risk in South Asia and satellite tracking of wild waterfowl. Ecohealth. , (2010).
