الطفرات وتحليل الطفرات الوراثية في تسلسل القيادة العامة الغنية مستقبلات KISS1 المحددة في البشر يعانون من اضطرابات الإنجابية
Summary
ترتبط طفرات في مستقبلات kisspeptin (KISS1R) يعانون من اضطرابات الإنجابية في المرضى. نحن هنا تصف كيفية إدخال طفرات مهمة في تسلسل القيادة العامة الغنية KISS1R فضلا عن استخدام بنيات KISS1R لتوصيف مسار تدهور بواسطة مستقبلات مناعي وصمة عار الغربية.
Abstract
مستقبلات kisspeptin (KISS1R) هو مجموعة مستقبلات البروتين يقترن المعترف بها على الزناد من البلوغ ومنظم من الكفاءة التناسلية في مرحلة البلوغ 1،2،3. وقد ارتبطت طفرات في تعطيل KISS1R المحددة في المرضى الذين يعانون من ناقص موجهة الغدد التناسلية iodiopathic 1،2 (IHH) قصور الغدد التناسلية والبلوغ المبكر 4. الدراسات الفنية لهذه المسوخ حاسمة الأهمية بالنسبة لفهمنا للآليات الكامنة وراء تنظيم هذا الاستنساخ بواسطة مستقبلات فضلا عن تشكيل لنتائج المرض الذي ينجم عن إشارات KISS1R غير طبيعي وظيفة. ومع ذلك ، فإن تسلسل للغاية GC – الغنية من الجين KISS1R يجعل من الصعب أن أعرض بدلا الطفرات أو تضخيم هذا الجين الترميز بواسطة مستقبلات PCR.
نحن هنا تصف طريقة لإدخال طفرات من الفائدة في هذا التسلسل للغاية GC – الغنية التي استخدمت بنجاح لتوليد أكثر من المسوخ KISS1R عشرة في المختبر لدينا. ونحن الأمثل لتسهيل ظروف PCR التضخيم من مجموعة من المسوخ التي تشمل استبدال KISS1R ، والحذف أو الإدراج في التسلسل KISS1R. إضافة إلى حل محسن PCR ، فضلا عن نسبة مئوية صغيرة من DMSO كانت مفيدة بشكل خاص لتحسين التضخيم. قد يكون هذا الإجراء مفيدا الأمثل لقوالب GC – الغنية الأخرى كذلك.
واستخدمت ناقلات ترميز KISS1R التعبير لوصف الإشارات وظيفة هذا المستقبل من أجل أن نفهم كيف يمكن أن تغير KISS1R الطفرات وظيفة ، وتؤدي إلى الظواهر المرتبطة التناسلي. تبعا لذلك ، يمكن أن يتضح من التطبيقات المحتملة الناتجة عن المسوخ KISS1R الطفرات في الموقع من إخراج العديد من الدراسات 1،4،5،6،7،8. كمثال على ذلك ، وقد تبين الطفرة كسب من بين وظيفة في KISS1R (Arg386Pro) ، الذي يرتبط مع سن البلوغ المبكر ، إلى إطالة أمد استجابة لتحفيز مستقبلات يجند 4 وكذلك لتغيير معدل تدهور KISS1R 9 . ومن المثير للاهتمام ، والدراسات لدينا تشير إلى أن KISS1R هو المتدهورة التي proteasome ، في مقابل تدهور في الليزوزومية الكلاسيكية وصفها لمعظم مستقبلات البروتين يقترن G 9. في المثال المعروض هنا ، هو التحقيق تدهور KISS1R في خلايا الكلى البشرية الجنينية (كلوة الجنين البشري – 293) معربا عن عابر Myc الموسومة KISS1R (MycKISS1R) وتعامل مع مثبطات proteasome أو يحلول. وimmunoprecipitated lysates الخلية باستخدام agarose – مترافق المضادة للأجسام المضادة myc يليه تحليل لطخة غربية. يتم إجراء الكشف النوعي والكمي لMycKISS1R على البقع باستخدام نظام أوديسي LI – COR الأشعة تحت الحمراء. قد يكون هذا النهج مفيدا في دراسة تدهور البروتينات الأخرى ذات الاهتمام كذلك.
Protocol
Discussion
وقد استخدمت موقع الطفرات الموجهة لدراسة وظيفة البروتين من خلال إدخال تغييرات في تسلسل النوكليوتيدات ترميز الجينات المستهدفة على مدى ثلاثة عقود. وقد وصفت هذه التقنية الأصلي في عام 1978 من قبل الصيدلي البريطاني والكندي الحائز على جائزة نوبل مايكل سميث 10. المشتركة…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل فرع الإنجابية من المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (معاهد الصحة القومية — R21 HD059015) والتي H. تشارلز هود الطفل مؤسسة جائزة الباحث الشاب بحوث الصحية (بوسطن ، ماساتشوستس).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 10x PCRx Enhancer Solution | Invitrogen | 52391 |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase Alternative Detergent | Stratagene | 600385 |
| Dpn-I | New England Biolabs | R0176 |
| XL10-Gold Ultracompetent E. coli cells | Stratagene | 200314 |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 |
| Geneporter Transfection Reagent | Genlantis | T201007 |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 |
| MG132 | Calbiochem | 47491 |
| 10xPBS | Ambion | AM9625 |
| Protease inhibitor cocktail and PMSF | Santa Cruz Biotechnology | Sc-24948 |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
| anti-Myc tag (clone 4A6) agarose conjugate | Millipore | 16-219 |
| 2x loading buffer | BioRad | 161-0737 |
| Criterion Tris-HCl precast gel, 4-15% gradient | BioRad | 345-0028 |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Millipore | IPFL00010 |
| Odyssey Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 |
| 10xTBS | BioRad | 170-6435 |
| Rabbit anti-myc antibody | Cell signaling | 2272 |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR Biosciences | 926-32211 |
| Odyssey Imaging Infrared System | LI-COR Biosciences | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 78430 |
Referencias
- Seminara, S. B., Messager, S., Chatzidaki, E. E. The GPR54 Gene as a Regulator of Puberty. N Engl J Med. 349, 1614-1627 (2003).
- de Roux, N., Genin, E., Carel, J. C. Hypogonadotropic Hypogonadism Due to Loss of Function of the KiSS1-Derived Peptide Receptor GPR54. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 10972-10976 (2003).
- Messager, S., Chatzidaki, E. E., Ma, D. Kisspeptin Directly Stimulates Gonadotropin-Releasing Hormone Release via G Protein-Coupled Receptor 54. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1761-1766 (2005).
- Teles, M. G., Bianco, S. D., Brito, V. N. A GPR54-Activating Mutation in a Patient with Central Precocious Puberty. N Engl J Med. 358, 709-715 (2008).
- Tenenbaum-Rakover, Y., Commenges-Ducos, M., Iovane, A. Neuroendocrine Phenotype Analysis in Five Patients with Isolated Hypogonadotropic Hypogonadism due to a L102P Inactivating Mutation of GPR54. J Clin Endocrinol Metab. 92, 1137-1144 (2007).
- Semple, R. K., Achermann, J. C., Ellery, J. Two Novel Missense Mutations in G Protein-Coupled Receptor 54 in a Patient with Hypogonadotropic Hypogonadism. J Clin Endocrinol Metab. 90, 1849-1855 (2005).
- Wacker, J. L., Feller, D. B., Tang, X. B. Disease-Causing Mutation in GPR54 Reveals the Importance of the Second Intracellular Loop for Class A G-Protein-Coupled Receptor Function. J Biol Chem. 283, 31068-31078 (2008).
- Szereszewski, J. M., Pampillo, M., Ahow, M. R. GPR54 regulates ERK1/2 activity and hypothalamic gene expression in a Galpha(q/11) and beta-arrestin-dependent manner. PLoS One. 5, e12964-e12964 (2010).
- Bianco, S. D. C., Vandepas, L., Correa-Medina, M., Gereben, B., Mukherjee, A., Kuohung, W., Carroll, R., Teles, M. G., Latronico, A. C., Kaiser, U. B. KISS1R Intracellular Trafficking and Degradation: Effect of the Arg386Pro Disease-Associated Mutation. Endocrinology. , (2011).
- Hutchison, C. A., Phillips, S., Edgell, M. H. Mutagenesis at a Specific Position in a DNA Sequence. J Biol Chem. 253, 6551-6560 (1978).
- Mullis, K. B. The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction. Sci Am. 262, 56-61 (1990).
- Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S. A. Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences. Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).
- Sahdev, S., Saini, S., Tiwari, P., Saxena, S., Singh Saini, K. Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions. Mol Cell Probes. 21, 303-307 (2007).
- Kong, K. C., Poyner, D. R., Wheatly, M. Chapter 10. MSTA. in G Protein-Coupled Receptors: Essential Methods. , 197-204 (2010).
- Hall, R. A., George, S. R., O’Dowd, B. F. Chapter 9. G protein-Coupled Receptor-Protein Interactions. , 170-171 (2005).
- Chaturvedi, K., Bandari, P., Chinen, N., Howells, R. D. Proteasome Involvement in Agonist-Induced Down-Regulation of Mu and Delta Opioid Receptors. J Biol Chem. 276, 12345-12355 (2001).
- Shenoy, S. K., McDonald, P. H., Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of Receptor Fate by Ubiquitination of Activated Beta 2-Adrenergic Receptor and Beta-Arrestin. Science. 294, 1307-1313 (2001).
