표준 임상 Assays에 의해 탐지의 한도 이하 바이러스성로드와 HIV 감염된 개인의 확장 및 HIV - 1 RNA를 Quantifying
Summary
플라즈마 및 시퀀싱에서 HIV – 1 RNA 수준을 Quantifying하면 단일 HIV – 1 검출 한계 (50-75 사본 / ML) 아래 바이러스성로드와 개인의 genomes가 어렵습니다. 여기 우리는 안정적으로 0.3 복사 / ML에 HIV – 1 RNA를 측정하고 매우 낮은 바이러스성로드와 샘플에서 단일 게놈 시퀀싱에 의해 바이러스 genomes를 증폭하는 방법을 실시간 PCR 분석을 사용하여 플라즈마 바이러스 RNA를 추출하고 계량하는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
바이러스 유전자를 확장 및 표준 assays에 의해 검출 한계 (아래 50-75 사본 / ML) 아래 바이러스성로드와 HIV – 1 감염 개인의 HIV – 1 RNA를 quantifying 것은 환자의 바이러스성 역학 및 바이러스 호스트 상호 작용에 대한 통찰력을 얻기 위해 필요한 사람 자연 감염과 조합 antiretroviral 치료 (카트)에있는 사람을 제어합니다.
여기 하나의 게놈 시퀀싱 (SGS 프로토콜) 13, 19 및 정확하게 낮은 바이러스성로드 (단일 복사본 분석 (SCA) 프로토콜) 12, 20 환자에서 HIV – 1 RNA를 수치로 바이러스 genomes를 증폭하는 방법에 대해 설명합니다.
단일 복사본 분석이 감도는 플라즈마가 assayed되는 볼륨에 따라과 실시간 PCR 분석이다. 단일 바이러스 게놈은 플라즈마 7 ML에 감지되면 RNA 사본 번호는 0.3 복사 / ML 것으로보고됩니다. 분석은 RNA 추출의 효율성을위한 내부 통제 테스트를 가지고 있으며, DNA 또는 오염 가능성 증폭을위한 제어합니다. 환자 표본 세중의 단위로 측정됩니다.
단일 게놈 시퀀싱 분석 (SGS), 현재 널리 사용하고 이외의 노동 집약적인 3, 7, 12, 14, 15로 간주는 끝점이 cDNA 제품이 96 자 이상 전염됩니다 희석하는, 제한 희석 분석입니다 판. Poisson 분포에 따르면, 적은 우물의 1 / 3 이상이 제품을 줄 때, 하나의 cDNA 분자에서 증폭의 PCR 제품되는 결과의 80 % 기회가 있습니다. SGS는 resampling의 대상이되지 및 PCR – 도입된 재조합 19 적이어서하지 복제를 통해 장점이 있습니다. 그러나, SCA와 SGS의 증폭 성공 프라이머 설계에 따라 달라집니다. 두 assays는 HIV – 1 subtype B에 대한 개발되었다지만, 변화 primers, 프로브 및 표준에 의해 다른 subtypes와 게놈의 다른 지역에 적용할 수 있습니다.
Protocol
1. 플라즈마의 큰 볼륨에서 RNA의 추출 단일 복사본 분석 (SCA)의 개요 및 단일 게놈 시퀀싱 (SGS) 프로토콜은 그림 1과 2에 제공됩니다. 플라즈마 7 ML을 얻으려면, 제동없이 15 분 동안 2,600 XG에 (헤파린되지 않음) 수집 튜브를 15 ML EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에서 수집된 혈액의 약 14 ML을 돌린다. 피펫 플라즈마 (버피 코트 레이어를하지 않아야 만들기) 15 ML 튜브로….
Discussion
HIV – 1 감염을 자연스럽게 제어 감염 조합 antiretroviral 치료에 대한 개인 (카트) 또는 매우 낮은 바이러스성로드, 플라즈마 4, 11, 12, 17, 18 ML 당 일반적으로 한 주변의 복사본을 가지고. 자연 컨트롤과 환자의 바이러스성로드는 종종 개인의 세트 포인트 1, 2, 17 주변 변동. assays의 감도는 여기에 플라즈마의 입력 볼륨에 크게 의존 설명했다. 일반적으로, 우리는 플라즈마 7 ML로 일하고 ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 HIV – 1의 많은 연구에 참여한 환자를 인정하고 싶습니다.
JMC는 FM 커비 재단의 지원으로 미국 암 협회의 연구 교수되었습니다.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Random hexamers (500 ug/ml) | Promega | C118A | |
| Taqman buffer A | Applied Biosystems | 4304441 | |
| RNAsin (40 U/ul) | Promega | N211B | |
| RT enzyme (200 U/ul) | Strategene | 600107-51 | |
| Amplitaq Gold DNA polymerase | Applied Biosystems | 4311814 | 6-pack |
| Amplitaq 10XGold PCR buffer II | Applied Biosystems | 4311814 | comes with the enzyme |
| Magnesiumcloride 25 mM | Applied Biosystems | 4311814 | comes with the enzyme |
| 1M Tris-HCl buffer, pH 8.0, 5 mM | Invitrogen | AM9855G | |
| Superscript III reverse transcriptase enzyme, 200 U/ul | Invitrogen | 18080-044 | |
| Superscript III 10X buffer | Invitrogen | comes with the enzyme | |
| DTT 100 mM | Invitrogen | comes with the enzyme | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity 5 U/ul | Invitrogen | 11304-102 | |
| 10X High Fidelity PCR Buffer | Invitrogen | 11304-102 | comes with the enzyme |
| Proteinase-K 20 mg/ml | Ambion | 2546 | |
| Guanidinium Thiocyanate solution 6M | FlukaBiochemica | 50983 | |
| Glycogen 20 mg/ml | Roche | 10901393001 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 19516 | |
| Ethanol 70% | Sigma-Aldrich | E702-3 | |
| Molecular grade water | Gibco/Invitrogen | 10977-015 | |
| dNTPs (25 mmol each) | Bioline | BIO-39025 |
| Name of Euipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Easy Seal Centrifuge Tubes (16x73mm) | Seaton Scientific | 6041 | |
| White Delrin crowns | Seaton Scientific | 4020 | Caps for the Easy Seal Tubes |
| Tube Rack for Optiseal Bell-Top Tubes, 8.9 ml | Beckman | 361642 | |
| Hex driver ½ inc opening | Seaton Scientific | 4013 | |
| cap removal tupe | Seaton Scientific | 4014 | |
| 5 ml serological pipettes | Costar | 4051 | |
| Pipetboy | any | ||
| 15 ml Transfer pipettes | ISC Bioexpress | P-5005-7 | |
| 5.8 ml Dispossable transfer pipettes, fine tip | VWR | 14670-329 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Falcon | ||
| 1 ml centrifuge tubes | any | ||
| Tris buffer Saline tablets | Sigma-Aldrich | T5030-100TAB | |
| Ultracentrifuge and rotor | Sorval | 90SE and T-1270 | |
| 96-well PCR plates | Biorad | HSS-9601 | |
| 50 ml Reagent reservoir | Costar | 4870 | |
| Microamp optical 96-well reaction plate | Applied Biosystems | N801-0560 | |
| Optical plate covers | Applied Biosystems | 4333183 | |
| MicroAmp Optical Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | |
| Microseal A film | Biorad | MSA-5001 | |
| 2 ml centrifuge tubes | Any | ||
| 1% agarose gels (E-gel, invitrogen) | Invitrogen | G-7008-01 | |
| E-base (Invitrogen) | Invitrogen | EB-M03 |
EDTA Collection tubes any brand
Referencias
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Mens, H., Kearney, M., Wiegand, A., Spindler, J., Maldarelli, F., Mellors, J. W., Coffin, J. M. Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays. J. Vis. Exp. (55), e2960, doi:10.3791/2960 (2011).