Model Herpesvirüs Litik çoğaltma Diseksiyon Host-virüs Etkileşim
Summary
Biz bir model herpes, gamma herpes 68 (γHV68) litik çoğaltma konak sinyal molekülleri arasında önemli rolleri tanımlamak için bir protokol açıklar. Genetiği değiştirilmiş fare suşları ve γHV68 litik replikasyon için embriyonik fibroblastlar kullanarak, protokol fenotipik karakterizasyonu ve viral litik çoğaltma virüs konak etkileşimler moleküler sorgulama hem de izin verir.
Abstract
Viral enfeksiyon yanıt olarak, bir dizi gibi antiviral sitokin üretimini 1,2 yol doğuştan gelen bağışıklık sinyal yolakları aktive gibi çeşitli savunma yanıtları, geliştirir. Ana koloni için, virüs konak antiviral yanıtları kaçmasına ve sinyal yolları işlemek için zorunlu bulunmaktadır. Konak-virüs etkileşimi unraveling viral enfeksiyona karşı yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi ışık tutacaktır.
Mürin γHV68 yakından insan onkojenik Kaposi sarkomu-ilişkili herpes ve Epsten-Barr virüsü 3,4 ilişkilidir. laboratuvar farelerde γHV68 enfeksiyonu insan herpesvirüslerinin için mevcut değildir vivo, konak yanıtları ve viral enfeksiyon tüm kurs incelemek için uysal küçük bir hayvan modeli sağlar. Bu protokol, biz γHV68 litik replic bir fenotipik karakterizasyon yöntemleri paneli ve ana sinyal bileşenlerinin moleküler diseksiyonu sunmakvivo ve ex vivo hem ation. Genetiği değiştirilmiş fare suşlarının durumu vivo γHV68 akut enfeksiyon sırasında ana sinyal yollarının rolleri sorgulamaya izin verir. Buna ek olarak, bu eksik fare suşu izole edilmiş fare embriyo fibroblast (MEFS) ileri γHV68 litik çoğaltma ex vivo sırasında bu moleküllerin rolleri incelemek için kullanılabilir.
Virolojik ve moleküler biyoloji deneyleri kullanarak, konak-virüs etkileşimlerinin moleküler mekanizması kesin ve viral litik replikasyon için gerekli ana ve viral genleri tespit edebilirsiniz. Son olarak, bakteriyel suni bir kromozom (BAC) sistemi özellikle ev sahibi-virüs etkileşim kesme viral faktör (ler) içine mutasyonların girişini kolaylaştırır. Bu mutasyonlar taşıyan rekombinant γHV68 bileşenleri sinyal anahtar konak içinde eksik MEFS içinde γHV68 litik çoğaltma fenotipleri tekrarlamak için de kullanılabilir.Bu protokol vivo ve ex vivo müdahale birden çok düzeyde konak-patojen etkileşimi sorgulamak için mükemmel bir strateji sunar.
Son zamanlarda, biz γHV68 usurps doğuştan gelen bağışıklık sinyalizasyon yolağı viral litik replikasyon 5 teşvik etmek olduğunu keşfettiler. Özellikle, γHV68 de novo enfeksiyonu bağışıklık kinaz IKKβ aktive Olmanız IKKβ viral transkripsiyonel aktivasyon teşvik etmek, ana viral transkripsiyon faktörü, çoğaltma ve Transaktivatörü (RTA) fosforile. Bunu yaparken, γHV68 verimli çiftler doğal immün aktivasyon ev sahipliği için transkripsiyonel aktivasyon, böylece viral transkripsiyon ve litik replikasyon kolaylaştırmak. Bu çalışmada ana-virüs etkileşimi sorgulamak diğer virüsler uygulanabilir mükemmel bir örnek sağlar.
Protocol
Discussion
Viral enfeksiyon yanıt olarak, Mavs-bağımlı doğuştan gelen bağışıklık sinyal yollarının antiviral 10-14 enflamatuvar sitokinlerin üretimini teşvik etmek için aktif hale getirilir. İnsan onkojenik Kaposi sarkomu-ilişkili herpes ve Epstein-Barr virüsü 3,4 için model virüs olarak mürin γHV68 kullanarak, γHV68 usurps Mavs-IKKβ yolu transkripsiyonel aktivasyonu 5 ile viral litik replikasyon teşvik etmek olduğunu keşfetti. Genetiği değiştirilmiş MEFS ve molekü…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Dr James (Zhijian) teşekkür etmek istiyorum Mavs içeren esansiyel reaktifleri, sağlamak için Chen (Güneybatı UT, Moleküler Biyoloji) – / – fareler ve Dr Ren Sun (California-Los Angeles Üniversitesi, Farmakoloji ve Moleküler Tıp ) bu çalışma için γHV68 bakteriyel yapay kromozom sağlamak için.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 |
| Electro-MAX DH10B competent cells | Invitrogen | 18290-015 |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 |
| POWERPREP HP Plasmid Miniprep System | OriGene | NP100004 |
| POWERPREP HP Plasmid Midiprep System | OriGene | NP100006 |
Referencias
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124, 783-801 (2006).
- Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449, 819-826 (2007).
- Speck, S. H., Virgin, H. W. Host and viral genetics of chronic infection: a mouse model of gamma-herpesvirus pathogenesis. Curr. Opin. Microbiol. 2, 403-409 (1999).
- Speck, S. H., Ganem, D. Viral latency and its regulation: lessons from the gamma-herpesviruses. Cell Host Microbe. 8, 100-115 (2010).
- Dong, X. Murine gamma-herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to initiate lytic replication. PLoS Pathog. 6, e1001001-e1001001 (2010).
- Strauss, W. M., Ausubel, F. M. Preparation of genomic DNA from mammalian tissues. Current Protocols in Molecular Biology. , 2-2 (1998).
- Song, M. J. Identification of viral genes essential for replication of murine gamma-herpesvirus 68 using signature-tagged mutagenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 3805-3810 (2005).
- Hirt, B. Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures. J. Mol. Biol. 26, 365-369 (1967).
- Eva-Maria Borst, E., Crnkovic-Mertens, I., Messerle, M., Zhao, S., Stodolsky, M. Cloning of β-herpesvirus genomes as bacterial artificial chromosomes. Methods in Molecular Biology. , 256-256 (2004).
- Sun, Q. The specific and essential role of MAVS in antiviral innate immune responses. Immunity. 24, 633-642 (2006).
- Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122, 669-682 (2005).
- Kawai, T. IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction. Nat. Immunol. 6, 981-988 (2005).
- Meylan, E. Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus. Nature. 437, 1167-1172 (2005).
- Xu, L. G. VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-beta signaling. Mol. Cell. 19, 727-740 (2005).
