"過酸化"と"酸化"ヒドロキシルラジカルフットプリントにより、RNAの構造における均衡の変化を監視する
Summary
このプロトコルは、Mg（II）依存性ヒドロキシルラジカルフットプリンティングの2つの方法でRNA三次構造の形成を定量化する方法について説明します。
Abstract
RNA分子は、生物学において重要な役割を果たしている。遺伝情報を伝達することに加えて、RNAはレギュレータ、バインダーや触媒などの特定の生物学的役割を果たすユニークな立体構造に折りたたまれることができる。三次接触の形成についての情報は、RNA分子の機能を理解することが不可欠です。ヒドロキシルラジカル（•OH）は、その高い反応性と小さなサイズのため、核酸の構造のユニークなプローブである。1フットのプローブとして使用する場合は、ヒドロキシルラジカルがDNAを1とを有するRNA 2のホスホジエステルバックボーンの溶媒接触可能表面をマッピング一塩基の解像度と同じくらい素晴らしい。ヒドロキシルラジカルフットプリンティングはDNA -タンパク質1とRNA -タンパク質複合体で、例えば、分子間の接触面内のヌクレオチドを識別するために使用することができます。平衡3と4の遷移運動は、solutiの関数としてヒドロキシルラジカルフットプリンティングを行うことによって決定することができます変数または時間で、それぞれ。フットプリントの主な特徴は、プローブにその限られた暴露（例えば、"シングルヒット動力学"）ポリマーの各ヌクレオチドの均一サンプリングの結果です。5
このビデオの記事では、我々は、RNAサンプルの調製およびMg（II）を介したフォールディング等温線の測定を説明するために、 テトラヒメナのリボザイムのP4 – P6のドメインを使用してください。我々は、H 2 O 2（我々はこの"過酸化"プロトコルと呼ぶ）と自然に溶存O 2を使用している貴重な、しかし広く知られていない、別のを（我々が呼ぶこの"必要とするよく知られているヒドロキシルラジカルフットプリンティングプロトコルの使用を説明し酸化'プロトコル）。データの削減、変換および分析手順の概要が提示される。
Protocol
1。フットプリントの試薬の調製 100mMのカコジル酸ナトリウム、1mMのEDTA、および1 M KClを含む10 ×反応バッファーを準備します。 7.4にpHを調整する。 0.2μMのアセテートフィルターデバイス（Nalgene）を使用してバッファをフィルタリングする。備考：10 ×バッファに直接ピペットのRNAをしないでください。 表1に示すように、各反応の滴定の反応ミックスを調製する。滴定のミック…
Discussion
ヒドロキシルラジカルフットプリントは、核酸の溶媒接触可能表面積を評価する貴重なツールです。三次構造14の定性的および定量的な形成は、イオンの種類や濃度、pH、温度、結合タンパク質または折りたたみ共同因子としてのパラメータの関数として追跡することができる。まっすぐ進むと安価なプロトコルの強力な組み合わせと単一ヌクレオチドレベルで、その結果、溶媒アク?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、健康RO1 – GM085130の国立研究所と国立科学財団MCB0929394からの補助金によって支えられている。私たちは、彼女のもてなしのためにと彼女の研究室でフィルムに私たちを可能にするための博士マリオンシュミットに感謝。
Materials
| Name | Company | Cat# |
|---|---|---|
| Sodium Cacodylate (Caution! Toxic) | Sigma | C4945-25g |
| EDTA (0.5 M) | Ambion | AM9260G |
| DEPC treated water | Ambion | AM9915G |
| Sodium Acetate (3 M) | Ambion | AM9740 |
| MgCl2 (1 M) | Ambion | AM9530G |
| Urea | Ambion | AM9902 |
| Sodium Citrate | Sigma | W302600 |
| tRNA | Sigma | R-7876 |
| Sodium-L-ascorbate | Sigma | A7631-25g |
| Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O | Sigma | F1543-500g |
| RNase T1 | Fermentas | EN0541 |
| Hydrogen Peroxide (30%) | Sigma | 349887 |
Referencias
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Bachu, R., Padlan, F. S., Rouhanifard, S., Brenowitz, M., Schlatterer, J. C. Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by ‘Peroxidative’ and ‘Oxidative’ Hydroxyl Radical Footprinting. J. Vis. Exp. (56), e3244, doi:10.3791/3244 (2011).