We hebben een protocol voor de inductie van cardioblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke voorouders hart-en functionele cardiomyocyten voor hart-en reparatie mogelijk maakt.
Tot op heden heeft het ontbreken van een geschikte humane cardiale cel bron is de grote tegenslag in het regenereren van de menselijke hartspier, hetzij door cel-gebaseerde transplantatie of door het hart tissue engineering 1-3. Cardiomyocyten geworden terminaal-gesplitste kort na de geboorte en verliezen hun vermogen om te woekeren. Er is geen bewijs dat de stam / voorlopercellen cellen, afkomstig van andere bronnen, zoals het beenmerg of het navelstrengbloed, kunnen aanleiding geven tot het contractiele hartspiercellen na transplantatie in het hart 1-3. De noodzaak om regenereren of herstellen van de beschadigde hartspier niet is voldaan door volwassen stamceltherapie, zowel endogeen of via cel levering 1-3. De genetisch stabiele menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) hebben onbeperkte uitbreiding capaciteit en onbeperkte plasticiteit, proffering een pluripotent reservoir voor in vitro afleiding van grote voorraden van menselijke somatische cellen die worden beperkt tot de afstamming in noodvan herstel en regeneratie 4,5. Als gevolg van de prevalentie van hart-en vaatziekten wereldwijd en acuut tekort aan donororganen, is er intense belangstelling voor de ontwikkeling hESC-gebaseerde therapieën als een alternatieve benadering. Echter, hoe de grote differentiatie potentieel van pluripotente hESC 's kanaal efficiënt en voorspelbaar om een gewenste fenotype is een grote uitdaging voor zowel de ontwikkeling en klinische studie vertaling. Conventionele benaderingen vertrouwen op multi-lijn helling van pluripotente cellen door spontane kiemlaag differentiatie, wat resulteert in inefficiënte en oncontroleerbare lineage-inzet die vaak wordt gevolgd door fenotypische heterogeniteit en instabiliteit, dus een hoog risico op tumorgeniciteit 6-8 (zie een schema in Fig. 1A). Daarbij mag undefined buitenlandse / dier biologische aanvullingen en / of feeders die typisch zijn gebruikt voor de isolatie, uitbreiding en differentiatie van hESC 's direct gebruik maken van een dergelijke cel-specialized grafts bij patiënten problematisch 9-11. Om deze obstakels, hebben we besloten de elementen van een bepaalde cultuur-systeem noodzakelijk en voldoende voor het behoud van de epiblast pluripotence van hESC 's, die als een platform voor de novo afleiding van klinisch-geschikte hESC' s en effectief te regisseren die hESC 's uniform naar klinisch relevante lineages door kleine moleculen 12 (zie een schematisch in Fig. 1B). Na het screenen van een groot aantal kleine moleculen en groeifactoren, vonden we dat een dergelijke omschreven voorwaarden gerenderd nicotinamide (NAM) voldoende is om de specificatie van cardiomesoderm rechtstreeks van pluripotente hESC 's die verder gevorderd om te cardioblasts dat de menselijke slaan cardiomyocyten gegenereerd met hoog rendement te induceren (figuur 2 ). Definieerden we de voorwaarden voor de inductie van cardioblasts rechtstreeks van pluripotente hESC 's zonder tussenkomst van een multi-lijn embryoid body fase, waarin goed gecontroleerde efficiënte afleiding van eengroot aanbod van menselijke hartcellen over het gehele spectrum van de ontwikkelingsstadia van cel-gebaseerde therapieën.
Een van de belangrijkste uitdagingen voor zowel de ontwikkeling en klinische studie vertaling is hoe het brede differentiatie mogelijkheden van pluripotente menselijke stamcellen kanaal om een gewenst fenotype efficiënt en voorspelbaar. Hoewel dergelijke cellen kunnen spontaan differentiëren in vitro in de cellen van alle kiembladen door te gaan door middel van een multi-lijn aggregaat podium, in hESC-afgeleide multi-stam aggregaten (embryoid instanties), slechts een zeer kleine fractie van cellen (<2%) spontaan differentiëren tot cardiomyocyten 13-15 (Fig. 1A). Na immunoselection, de verrijkte populaties van cardiomyocyten in staat waren om te functioneren als biologische pacemakers aan de functie van een beschadigde hartspier te redden mechanisch en elektronisch na injectie in het hart van diermodellen 13. In knaagdier infarct modellen, geënt hESC-afgeleide cardiale nakomelingen waren in staat om te overleven en tot volwassen tot 12 weken, en gedeeltelijk remuscularize de gewonde hart en het verbeteren van de contractiele functie 14,15. Echter, de inefficiëntie in het genereren van menselijk hart-vastgelegde cellen door middel van multi-lijn differentiatie van pluripotente cellen en het hoge risico van tumorgeniciteit na de transplantatie gehinderd verdere klinische vertaling. Ontwikkelen van strategieën om de grote differentiatie potentieel van pluripotente hESC 's kanaal zich uitsluitend en voorspelbaar tot een hartaanval fenotype is van vitaal belang voor de kracht van hESC biologie in het hart veld. Met het oog op een uniforme omzetting van menselijke pluripotente stamcellen om een bepaalde lijn te bereiken, hebben we gebruik van een bepaalde cultuur systeem dat in staat het verzekeren van de verspreiding van ongedifferentieerde hESC 's uitsluitend te identificeren voorwaarden voor een goed gecontroleerde efficiënte inductie van pluripotente hESC' s om een bepaald klinisch relevante lijn door eenvoudige verstrekking van kleine moleculen (figuur 1B). Wij vonden dat nicotinamide geïnduceerde cardiale-lineage inzet rechtstreeks van pluripotent hESC 's onder bepaalde cultuur die verder gevorderd te slaan cardiomyocyten met hoog rendement (fig. 2). Nkx2.5 is een evolutionair geconserveerd homeobox transcriptie factor onmisbaar voor de normale ontwikkeling van het hart en mutaties van het gen geassocieerd zijn met de mens een aangeboren hartziekte (CHZ), de meest voorkomende menselijke geboorteafwijking 16. Expressie van Nkx2.5 is de eerste marker voor het hart voorloper cellen in alle gewervelde dieren tot nu toe onderzocht en is essentieel voor een goede cardiale septation en de vorming / rijping van elektrisch geleidingssysteem 16. In gewervelde dieren, het begin en het patroon van de vroege Nkx2.5 expressie ongeveer samenvallen met de timing en het gebied van cardiale specificatie in de vroege embryogenese en Nkx2.5 gen nog steeds worden uitgedrukt door middel van ontwikkeling in het hart 16. In ons hESC model, NAM bleek de cardiale inductie rechtstreeks van pluripotente hESC 's activeren door het bevorderen van de expressie van cardiaal-specifieke transcrikopen worden Nkx2.5 factor in een proces dat de specificatie van cardiomesoderm zou kunnen emuleren van de pluripotente epiblast in humane embryonale cardiogenese. Toekomstige studies zullen onthullen genetische en epigenetische controle moleculen in de menselijke ontwikkeling van het hart als alternatieven, die mogelijk de weg vrij te maken voor kleine molecule-gemedieerde directe controle en modulatie van hESC pluripotente het lot wanneer afleiden van klinisch relevante lineages voor regeneratieve therapieën. Zonder NAM behandeling, <2% hESC 's zullen spontane differentiatie ondergaan in slaan hartspiercellen 12-15. Met de NAM behandeling, zijn we in staat geweest om> 95% embryonale hart-precursoren en> 50% kloppende hartspiercellen van hESC 's gehandhaafd onder een te definiëren cultuur in een proces dat menselijke embryonale ontwikkeling van het hart 12 zou kunnen emuleren genereren. Onlangs hebben geweten cardiale-lot bepalen van genen is gebruikt om muizen fibroblasten transdifferentiate in post-natale slaan cardiomyocyten met een lage efficiëntie van <0,5% 17, 18 </ Sup>. Echter, opnieuw geprogrammeerd somatische cellen historisch werd geassocieerd met een abnormale genexpressie en versnelde veroudering met een verminderde therapeutische nut 19-21. Tot slot wordt het protocol waarin we gevestigd hier beperkt tot pluripotente hESC 's afgeleid van de binnenste celmassa (ICM) of epiblast van de menselijke blastocyst 4,5, mogelijk niet van toepassing op andere pluripotente cellen, met inbegrip van dieren afkomstige SER, SER afgeleid uit eerdere morula (acht-cel)-stadium embryo's 22, en kunstmatig geherprogrammeerde cellen 23.
The authors have nothing to disclose.
XHP werd ondersteund door National Institute of Health (NIH) subsidies van National Institute on Aging (NIHK01AG024496) en The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NIHR21HD056530).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Matrigel | BD bioscience | 356231 | Growth factor reduced |
Human laminin | Sigma | L6274 | |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 10565042 | |
DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
MEM amino acids solution (MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4403 | |
Human transferrin | Sigma | T8158 | |
Human bFGF | PeproTech | AF-100-18B | |
Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
Human activin A | PeproTech | 120-14E | |
Defined FBS | Hyclone | SH30073-03 | |
6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
6-well plate | Corning | 3516 |