Campo elétrico controlado de migração dirigida de células progenitoras neurais em ambientes 2D e 3D
Summary
Este protocolo demonstra métodos utilizados para estabelecer ambientes 2D e 3D em câmaras de design personalizado electrotactic, que pode acompanhar células<em> In vivo / ex vivo</em> Usando lapso de tempo de gravação no nível da célula única, a fim de investigar galvanotaxis / electrotaxis e outras respostas celulares ao dirigir atuais campos (DC) elétricos (EFS).
Abstract
Endógenos campos eléctricos (EFS) ocorrem naturalmente in vivo e desempenham um papel crítico durante tecido / órgão de desenvolvimento e regeneração, incluindo a do 1,2 sistema nervoso central. Estes EFs endógenos são gerados por regulação celular de transporte iónico combinada com a resistência eléctrica de células e tecidos. Tem sido relatado que aplicada EF tratamento pode promover a reparação funcional de lesões da medula espinal em animais e humanos 3,4. Em particular, EF-dirigida a migração celular tem sido demonstrada em uma ampla variedade de tipos de células 5,6, incluindo as células progenitoras neurais (NPCs) 7,8. Aplicação de corrente direta (DC) FE não é uma técnica comumente disponíveis na maioria dos laboratórios. Nós descrevemos os protocolos de execução de FE DC para celular e culturas de tecidos previamente 5,11. Aqui apresentamos um vídeo de demonstração de métodos padronizados com base em uma intensidade de campo calculada para configurar uma 2Dd ambientes 3D para NPCs, e investigar respostas celulares a EF estimulação em ambas as condições unicelulares de crescimento em 2D, ea fatia de medula espinhal organotípico em 3D. O cordslice vertebral é um tecido destinatário ideal para estudar comportamentos NPC ex vivo, pós-transplante, porque a organização do tecido citoarquitetônicos está bem preservada dentro dessas culturas 9,10. Além disso, este modelo ex vivo também permite que os procedimentos que não são tecnicamente viável para controlar as células in vivo utilizando lapso de tempo de gravação ao nível da célula individual. É extremamente essencial para avaliar comportamentos de células em não só um ambiente 2D, mas também numa condição 3D organotípico que imita o ambiente de vivo. Este sistema permitirá que imagens de alta resolução usando tampa de vidro pratos à base de tecido ou cultura de órgão com rastreamento 3D da migração única célula in vitro e ex vivo e pode ser uma etapa intermediária antes de passar para a viparadigmas vo.
Protocol
Discussion
Os protocolos que usamos são baseadas em estudos anteriores 5,11. Usando esses métodos de cultura, estável e elétrico condições atuais pode ser mantida enquanto a aplicação de um EF através de pontes de ágar, solução Steinberg e Ag / AgCl, para células ou fatias cultivadas em câmaras electrotactic custom-concebidas de dimensões padronizadas e precisas. A profundidade das câmaras pode ser ajustada para acomodar diferentes espessuras amostra 11, e, no caso de células, o tamanho da c?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Royal Society URF concessão UF051616, Reino Unido e do Conselho Europeu de Investigação StG concessão 243261 a BS. O trabalho em laboratório MZ é também apoiada por um Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia concessão RB1-01417.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| FGF-basic Recombinant Human | Invitrogen | PHG0026 | 20 ng/mL |
| EGF Recombinant Human | Invitrogen | PHG0311 | 20 ng/mL |
| N2-Supplement (100X) liquid | Invitrogen | 02048 | |
| DMEM/F12 medium (high glucose) | Invitrogen | 31330-095 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Natural mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Growth factor reduced Basement Membrane Matrix (Matrigel) | B.D. Biosciences | 354230 | |
| HEPES buffer | Gibco | 15630 | |
| McIlwain tissue chopper | The Mickle Laboratory Engineering Co Ltd | TC752-PD | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554 |
Referencias
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