Synthese van een<em> In vivo</em> MRI detecteerbaar Apoptosis Probe
Summary
Vroege detectie van apoptose kan aanwijzen risicogroepen celpopulaties in een verscheidenheid aan ziekten. Hier laten we zien een methode om een vroege apoptose-detectie eiwit (Annexine V) te koppelen aan een MRI-detecteerbare nanodeeltjes ijzeroxide (SPIO). Deze methode kan worden uitgebreid tot andere eiwitten van belang om MRI-detecteerbare moleculaire probes voor medische beeldvorming te genereren.
Abstract
Cellulaire apoptose is een opvallend kenmerk van veel ziekten, en deze geprogrammeerde celdood treedt meestal op vóór de klinische verschijnselen van de ziekte zijn evident. Een middel om apoptose te sporen in zijn vroegste, omkeerbare stappen zou kunnen veroorloven een pre-klinische 'venster' waarin preventieve of therapeutische maatregelen kunnen worden genomen om het hart te beschermen tegen blijvende schade. Wij geven hierbij een eenvoudige en robuuste wijze menselijke Annexine V (ANX) die gretig aan cellen bindt in de vroegste fase van reversibele apoptose, geconjugeerd aan superparamagnetische ijzeroxide (SPIO) nanodeeltjes, die als een MRI-detecteerbaar contrastmiddel. De vervoeging methode begint met een oxidatie van de SPIO nanodeeltjes, die carboxylgroepen oxideert de polysaccharide schelp van SPIO. Gezuiverd eiwit wordt dan ANX toegevoegd in de omgeving van een natriumboraat-oplossing om covalente interactie van ANX vergemakkelijken SPIO in een reducerende buffer. Een laatste stap reductie met natrium borohydride wordt uitgevoerd om de vermindering voltooien en de reactie wordt geblust. Geconjugeerde ANX wordt uit het mengsel door microcentrifuge filtratie. De grootte en zuiverheid van de ANX-SPIO product wordt gecontroleerd door dynamische lichtverstrooiing (DLS). Deze methode vereist geen aanvulling op of wijziging van de polysaccharide SPIO shell, in tegenstelling tot cross-linked ijzeroxide deeltjes conjugatie methoden of biotine-gelabeld nanodeeltjes. Hierdoor is deze methode een eenvoudige, robuuste benadering kan worden uitgebreid tot andere conjugatie van eiwitten van interesse.
Protocol
Discussion
De beschreven werkwijze voor conjugatie aan het koppelen SPIO Annexine V gebruik van de zijketen amine groepen Annexine en carboxyl groepen van het SPIO nanodeeltjes. Door specifieke oxidatiereductie stappen kan covalente binding van deze verbindingen worden bereikt, en het resulterende gefunctionaliseerde nanodeeltjes kunnen worden geïsoleerd. Deze methode kan algemeen andere eiwitten en nanodeeltjes van belang.
De meest kritische stappen zijn oxidatie en reductieomstandigheden, in de juis…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
National Institutes of Health, NHLBI (RD, PY, PS).
American Heart Association (JL).
Stanford University, VPUE Grant (JL).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue # |
| Superparamagnetic iron oxide | Ocean Nanotech, Inc. | ICK-40-005 |
| Doxorubicin | Sigma | D1515-10MG |
| SuperMag Separator | Ocean Nanotech, Inc. | N/A |
| Zetasizer Nano DLS machine | Malvern, Inc | N/A |
Referencias
- Dash, R. A molecular MRI probe to detect treatment of cardiac apoptosis in vivo. Magn. Reson. Med. , (2011).
- Khym, J. X. The reaction of methylamine with periodate-oxidized adenosine 5′-phosphate. Bioquímica. 2, 344-350 (1963).
- Liu, Y. Y., Yu, Y., Zhang, G. B., Tang, M. F. Preparation, characterization, and controlled release of novel nanoparticles based on MMA/beta-CD copolymers. Macromol. Biosci. 7, 1250-1257 (2007).
- Seo, W. S. FeCo/graphitic-shell nanocrystals as advanced magnetic-resonance-imaging and near-infrared agents. Nat. Mater. 5, 971-976 (2006).
- Hsiao, J. K. Magnetic nanoparticle labeling of mesenchymal stem cells without transfection agent: cellular behavior and capability of detection with clinical 1.5 T magnetic resonance at the single cell level. Magn. Reson. Med. 58, 717-724 (2007).
- Zhao, M., Beauregard, D. A., Loizou, L., Davletov, B., Brindle, K. M. Non-invasive detection of apoptosis using magnetic resonance imaging and a targeted contrast agent. Nat. Med. 7, 1241-1244 (2001).
- van Tilborg, G. A. Internalization of annexin A5-functionalized iron oxide particles by apoptotic Jurkat cells. Contrast Media Mol. Imaging. 4, 24-32 (2009).
- Sosnovik, D. E. Magnetic resonance imaging of cardiomyocyte apoptosis with a novel magneto-optical nanoparticle. Magn. Reson. Med. 54, 718-724 (2005).
- Sosnovik, D. E. Molecular MRI detects low levels of cardiomyocyte apoptosis in a transgenic model of chronic heart failure. Circ. Cardiovasc. Imaging. 2, 468-475 (2009).
- Dumont, E. A. Cardiomyocyte death induced by myocardial ischemia and reperfusion: measurement with recombinant human annexin-V in a mouse model. Circulation. 102, 1564-1568 (2000).
- Blankenberg, F. G. In vivo detection and imaging of phosphatidylserine expression during programmed cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 6349-6354 (1998).
- Schellenberger, E. A., Sosnovik, D., Weissleder, R., Josephson, L. Magneto/optical annexin V, a multimodal protein. Bioconjug. Chem. 15, 1062-1067 (2004).
