Circuitos neuronales están topográficamente organizadas en compartimentos funcionales con determinados perfiles moleculares. Aquí, ofrecemos los pasos prácticos y técnicos para revelar la topografía global del cerebro mediante un método versátil wholemount tinción inmunohistoquímica. Se demuestra la utilidad del método que utiliza la citoarquitectura bien entendida y la circuitería de cerebelo.
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Artículo de método
La inmunohistoquímica wholemount de Topografía Revelando Complex Brain
En este artículo
Resumen
Resumen
La arquitectura repetida y bien entendido-celular del cerebelo lo convierten en un sistema modelo ideal para explorar la topografía cerebral. Detrás de su citoarquitectura relativamente uniforme es un complejo conjunto de dominios parasagitales de expresión génica y proteica. La compartimentación molecular del cerebelo se refleja en la organización anatómica y funcional de las fibras aferentes. Para apreciar plenamente la complejidad de la organización del cerebelo que previamente refinado un enfoque tinción wholemount de análisis de alto rendimiento de los defectos de modelado en el cerebelo de ratón. Este protocolo se describe en detalle los reactivos, instrumentos y medidas prácticas que son útiles para revelar los patrones de éxito de expresión de proteínas en el cerebelo de ratones adultos mediante el uso de inmunotinción wholemount. Los pasos resaltada aquí demuestran la utilidad de este método que utiliza la expresión de zebrinII / aldolaseC como un ejemplo de cómo la topografía fino del cerebro puede ser revelada en sunativo conformación tridimensional. También se describen las adaptaciones del protocolo que permite la visualización de expresión de la proteína en las proyecciones aferentes y cerebelo, sin limitación para los estudios comparativos de la topografía molecular. Para ilustrar estas aplicaciones, los datos de tinción aferente del cerebelo de rata están incluidos.
Protocolo
1. Los animales fueron perfundidos y disección Cerebelo
- Dependiendo de la proteína, la perfusión puede ser esencial para el 1,2 tinción con éxito. La perfusión transcardiaca es una técnica invasiva, no la supervivencia de procedimiento que requiere el uso apropiado de anestésicos. Formación adecuada, la aprobación institucional, y la aprobación del IACUC son necesarios antes de intentar el procedimiento. Siempre es una buena idea consultar a los veterinarios de la institución para obtener ayuda en la identificación de las necesidades experimentales y la adquisición de la formación correcta. Antes del procedimiento, el animal debe ser profundamen....
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Discusión
Hemos descrito los detalles técnicos necesarios para la tinción wholemount éxito utilizando un enfoque de inmunohistoquímica versátil para la expresión de la proteína revelador en el desarrollo del cerebro y de adultos. Mediante el uso de este enfoque, los patrones de expresión complejos moleculares pueden ser analizados y la topografía del cerebro apreciado sin la necesidad de laborioso y procedimientos que consumen tejidos de seccionamiento.
Este protocolo se ha utilizado para revelar la e.......
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
RVS con el apoyo de nuevo investigador de puesta en marcha de fondos de Albert Einstein College of Medicine de la Universidad Yeshiva.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Materiales | Función en el protocolo | ||
| La perfusión de la bomba (Fisher Scientific/13-876-2) | Permite la perfusión constante y lento. | ||
| Sharp-Tijeras de punta (FST/14081-08) | De uso general en la perfusión y la disección. | ||
| Blunt punta Pinzas (FST/91100-12) | Para estabilizar el corazón para la inserción de la aguja de perfusión. | ||
| Pinzas (FST por Dumont AA/11210-10) | Para su uso durante la disección del cerebro del cráneo y de separar el cerebelo del resto del cerebro. Estos son esenciales porque tienen una punta ligeramente redondeada que ayuda a minimizar el daño en el cerebelo durante la disección. | ||
| Nutator (Fisher Scientific) | Se utiliza para mantener el tejido en movimiento durante los períodos de incubación. | ||
| 1,5 ml tubo (Sarstedt / Tornillo Micro Tube) | Todos los pasos del suinmunohistoquímica protocolo llevará a cabo en estos microtubos. La parte inferior redondeada asegura que el cerebelo permanece en movimiento. | ||
| Una cuchara perforada (FST/10370-17) | Se utiliza para mantener wholemounts en los microtubos mientras que suavemente decantar la solución pasó. | ||
| Leica MZ16 FA microscopio | Se utiliza para examinar las manchas wholemount. | ||
| Leica DFC3000 FX cámara | Se utiliza para capturar imágenes wholemount. |
Tabla 1.
| Ejemplo de calendario para un experimento típico de wholemount | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Día 1 | Dent solución, la temperatura ambiente, 8 horas | Dent lejía, 4 ° C, durante la noche | ||||||
| Día 2 | 100% de MeOH, temperatura ambiente, 2x, 30 minutos cada uno | 100% MeOH, congelación / descongelación, 4x, 30 min min/15 | n = "2"> 100% de MeOH, -80 ° C, durante la noche | |||||
| Día 3 | 50% MeOH/50% PBS, a temperatura ambiente, 60-90 min | 15% de MeOH / 85% de PBS, a temperatura ambiente, 60-90 min | 100% de PBS, a temperatura ambiente, 60-90 min | 10μg/mL Proteinasa K en PBS, a temperatura ambiente, 2-3 min | 100% de PBS, a temperatura ambiente, 3x, 10 minutos cada uno | PMT, 4 º C, durante la noche | ||
| Día 4-5 | PMT + 1 ° de anticuerpos + 5% de DMSO, 4 ° C, 48 horas | |||||||
| Día 6 | PMT, 4 ° C, 2-3X, 2-3 horas cada uno | PMT + 2 ° de anticuerpos + 5% de DMSO, 4 ° C, 24 horas (o empezar los pasos de amplificación con complejo ABC) | ||||||
| Día 7 | PMT, 4 ° C, 2-3X, 2-3 horas cada uno | PBT, temperatura ambiente, 2 hrs | Incubar en DAB fresco en PBS hasta que la tinción óptima se visualiza | |||||
| Recetas (* = preparar fresca cada vez) | |
|---|---|
| PBS (tampón fosfato salino) | 0,1 M tampón fosfato salino en agua desionizada. pH 7,2 (Sigma; tabletas P4417) |
| PFA (paraformaldehído) | Fabricado y congelado almacenado como una solución al 20% y después se diluyó a 4% en PBS durante la solución de trabajo (Fisher Scientific; T353) |
| Dent fijadora de 3 * | 4 partes de metanol 1 parte de dimetilsulfóxido (DMSO, Fisher Scientific, D159-4) |
| Dent Bleach 3 * | 4 partes de metanol 1 parte de dimetilsulfóxido (DMSO, Fisher Scientific, D159-4) 1 parte de hidrógeno al 30% de peróxido |
| La digestión enzimática | 10 ug / ml de proteinasa K (Roche Diagnostics; 03115828001) en PBS. |
| PBST | PBS que contenía: 0,1% de Tween-20 (Fisher científico, BP337; Tritón también se puede utilizar en lugar de Tween-20 en todos los casos). |
| PMT 25 * | PBS que contenía: 2% de grasa de leche en polvo descremada (Clavel prefiere) 0,1% de Tween-20 (Fisher Scientific, BP337) |
| PBT 25 * | PBS que contenía: 0,2% de albúmina sérica bovina (Sigma; B9001S) 0,1% de Tween-20 (Fisher Scientific, BP337) |
| DAB * | Disuelva una tableta de 10 mg de 3,3-diaminobencidina (Sigma-Aldrich, D5905) en 40 ml de PBS. Añadir 10 l de peróxido de hidrógeno al 30% para iniciar la reacción). |
| ABC Complejo Solución | Vectastain kit (Vector Laboratories, Inc, PK-4000) |
Tabla 3.
Referencias
- Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount Immunohistochemistry: A high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. J. Histochem. Cytochem. 50, 235-244 (2002).
- Kim, S. -H., Che, P., Chung, S. -H., Doorn, D., Hoy, M., Larouche, M., Marzban, H., Sarna, J., Zahedi, S., Hawkes, R.
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Reimpresiones y permisos
