الشعرية قوة الطباعة الحجرية لهندسة الأنسجة القلبية
Summary
In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.
Abstract
لا تزال أمراض القلب والشرايين السبب الرئيسي للوفاة في العالم 1. هندسة الأنسجة القلبية يحمل الكثير من الأمل لتقديم الاكتشافات الطبية الرائدة مع أهداف تطوير أنسجة وظيفية لتجديد القلب، وكذلك في فحوصات المختبر فحص. ومع ذلك، فقد ثبت القدرة على خلق نماذج عالية الدقة من أنسجة القلب صعبة. القلب المصفوفة خارج الخلية (ECM) هو بنية معقدة تتألف من إشارات البيوكيميائية والنشاط الحيوي بدءا من الدقيقة لمقياس متناهي الصغر 2. ظروف التحميل الميكانيكية والتفاعلات خلية ECM المحلية في الآونة الأخيرة تم الاعتراف بها باعتبارها مكونات حيوية في هندسة الأنسجة القلبية 3-5.
ويتألف جزء كبير من ECM القلب من ألياف الكولاجين الانحياز بأقطار نانو النطاق الذي يؤثر بشكل كبير العمارة الأنسجة واقتران الكهروميكانيكية 2. للأسف، عدد قليل من الطرق هفه كان قادرا على تقليد تنظيم ألياف ECM وصولا الى مقياس متناهي الصغر. التطورات الأخيرة في تقنيات nanofabrication، ومع ذلك، مكنت تصميم وتصنيع السقالات تحجيم التي تحاكي في الجسم الحي العظة صلابة الهيكلية والركيزة للECM في قلب 6-9.
هنا نقدم تطوير اثنين من استنساخه، والعمليات nanopatterning قابلة للمحاذاة الوظيفية للخلايا القلب باستخدام البوليمر بولي حيويا (lactide-CO-glycolide) (PLGA) 8 والبولي يوريثان (PU) البوليمر المستندة فعالة من حيث التكلفة، و. هذه الطبقات التحتية nanofabricated anisotropically (ANFS) تحاكي ECM الكامنة وراء والأنسجة الانحياز منظمة تنظيما جيدا، ويمكن استخدامها للتحقيق في دور nanotopography على مورفولوجيا الخلايا وظيفة 10-14.
باستخدام nanopatterned (NP) سيد السيليكون كقالب، ولفق اكريليت البولي يوريثين (بوا) العفن. ثم يتم استخدام هذا القالب لبوا سنوياttern بو أو PLGA هيدروجيل عبر بمساعدة الأشعة فوق البنفسجية أو المذيبات بوساطة الطباعة الحجرية القوة الشعرية (كفل)، على التوالي 15،16. لفترة وجيزة، بو أو PLGA قبل البوليمر هو انخفاض الاستغناء على ساترة الزجاج ويوضع القالب بوا على القمة. لبمساعدة الأشعة فوق البنفسجية كفل، ومن ثم يتعرض بو للأشعة فوق البنفسجية (λ = 250-400 نانومتر) لعلاج. لبوساطة المذيبات كفل، هو منقوش على PLGA باستخدام الحرارة (120 درجة مئوية) وضغط (100 كيلو باسكال). بعد المعالجة، ومقشر القالب بوا قبالة، مخلفا وراءه ANFS للثقافة الخلية. الخلايا الأولية، مثل حديثي الولادة myocytes البطين الفئران، وكذلك الجذعية المشتقة من الخلايا العضلية المحفزة الإنسان، يمكن الحفاظ على ANFS 2.
Introduction
أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للمراضة والوفيات في العالم، وتقديم عبئا الاجتماعية والاقتصادية ذات الثقل على 1،17 النظام الصحي العالمي المتوترة بالفعل. هندسة الأنسجة القلبية لديه هدفين مختلفين: (1) لتجديد عضلة القلب التالفة بعد مرض نقص تروية عضلة القلب أو أو (2) لإنشاء نموذج عالي الدقة من القلب في المختبر لفحص المخدرات أو النمذجة المرض.
القلب هو جهاز معقد التي يجب أن تعمل باستمرار لتزويد الدم للجسم. يتم ترتيب الهياكل الصفحي المكتظ العضلية والأنسجة الداعمة في أنماط حلزونية في جميع أنحاء جدار القلب 18،19. كما يقترن قلب الكتروميكانيكية 20 بطريقة منسقة للغاية لإخراج الدم بكفاءة إلى الجسم 21. لا تزال العديد من العقبات الرئيسية التي يتعين معالجتها، ومع ذلك، قبل أن موثوق تلخيصها تصميم الطبيعة معقدة في المختبر.أولا، على الرغم من أن وسائل قوية cardiomyocyte التمايز مواصلة تطوير 22، hPSC-مضادة يزال يحمل الظواهر غير ناضجة إلى حد ما. هذه الخصائص الكهروميكانيكية والتشكل أكثرها توافقا مع مستويات الجنين 23. الثانية، عندما يوضع في ظروف الثقافة التقليدية، وفشل كل الجذعية المشتقة الخلايا العضلية الأولية وإلى التجمع في وهياكل الأنسجة مثل الأم. بدلا من ذلك، تصبح الخلايا موجهة بشكل عشوائي ولا يحمل تجمعت على شكل قضيب ظهور عضلة القلب الكبار 24.
وخارج الخلية المصفوفة (ECM) البيئة التي تتفاعل الخلايا تلعب دورا هاما في العديد من العمليات الخلوية 11،13،25. يتكون من ECM واضحة المعالم العظة معقدة، الجزيئية والطوبوغرافية التي تؤثر بشكل كبير على بنية ووظيفة خلايا 6،26. داخل القلب، والمحاذاة الخلوية تتابع عن كثب الألياف ECM مقياس متناهي الصغر الكامنة 2. تأثير هذه nanotopographالعظة كال على الخلايا والأنسجة وظيفة، ومع ذلك، لا يزال بعيدا عن المفهوم تماما. الدراسات الأولية للتفاعل خلايا بيولوجية مقياس متناهي الصغر تشير إلى الأهمية المحتملة وتأثير الفرعية ميكرون العظة الطبوغرافية للخلية مما يشير 27، التصاق 28-30، والنمو 31، والتمايز 32،33. ولكن نظرا لصعوبة في تطوير ركائز nanofabricated استنساخه وقابلة للتطوير، مثل هذه الدراسات لا يمكن أن تتكاثر آثار الخلوية متعددة على نطاق المجمع في بيئة ECM الجسم الحي. في هذا البروتوكول، وصفت تقنية nanofabrication واضحة وفعالة من حيث التكلفة لإنتاج السقالات خلية ثقافة محاكاة الأم محاذاة الألياف ECM القلب، مما يسمح لمجموعة واسعة من التحقيقات الرواية من التفاعلات cardiomyocyte مادة بيولوجية. يمكن فهم كيفية تفاعل العضلية مع البيئة ECM النانو تسمح القدرة على التحكم في السلوك الخلوية إلى أكثر من تقليد كثب ظائفه الأنسجة الأمنشوئها. علاوة على ذلك، الطبقات الوحيدة الخلية هي نظام تجريبية مبسطة مقارنة مع هياكل 3D ولكن لا يزال سلوكا متعددة الخلايا المعقدة للتحقيقات الثاقبة والفرز وظيفية 2،34-36. أخيرا، يمكن أن تستخدم مثل هذه السقالات لتحسين وظيفة الخلوية الكسب غير المشروع عندما زرعت في قلب لأغراض التجدد 37.
Protocol
Representative Results
Discussion
أنسجة القلب ناضجة وظيفيا التي يفتقر إليها سواء في الجسم الحي والتطبيقات في المختبر من هندسة الأنسجة القلبية. الأساليب nanofabrication كفل الموصوفة هنا هي تقنيات قوية لتحقيق المواءمة الخلوية والتأثير على وظيفة الأنسجة العيانية نظرا لقابلية النظام. ويمكن بسهولة أ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D. H. Kim thanks the Department of Bioengineering at the University of Washington for the new faculty startup fund. D. H. Kim is also supported by the Perkins Coie Award for Discovery, the Wallace H. Coulter Foundation Translational Research Partnership Award, the Washington State Life Science Discovery Fund, and the American Heart Association Scientist Development Grant (13SDG14560076). J. Macadangdang and A. Jiao thank the support from the NIH Bioengineering Cardiovascular Training Grant Fellowship. Additional support for this work comes from the National Institutes of Health (NIH) grant R01HL111197 to M. Regnier.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| NOA 76 | Norland Products, Inc. | 7606B | |
| Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) | Minuta Tech | ||
| PUA | Minuta Tech | MINS-311RM | |
| Soft Rubber Roller | Speedball | ||
| Silicon Wafers | NOVA Electronic Materials | FA01-9900 | |
| Photoresist | Shipley | SPRT510 | |
| Photoresist Developer | Shipley | MF320 | |
| Electron-Beam Lithography System | JEOL | JBX-9300FS | |
| Etching System | Surface Technology Systems | NP10 8UJ | |
| Plasma Asher System | BMR Technology Co. | DSF-200 | |
| Ozone Cure System | Minuta Tech | MT-UV-O- 08 | |
| Fusion Cure System | Minuta Tech | MT-UV-A 11 | |
| NOA 83H | Norland Products, Inc. | 8301 | |
| Spin Coater | Laurel Technology | WS-400-6NPP | |
| Skyrol PET Film | SKC Co., Ltd. | 23038-59-9 | |
| 25mm Glass Slides | Corning | 2948 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 6/5/2553 | |
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | P2191-1G | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978-1L | |
| 500g Weights | Global Insustrial | T9FB503120 | |
| Isopropyl Alcohol | EMD Millipore | PX1835-2 | |
| Hot Plate | Corning | PC-420D | |
| Sonicator | Branson | B2510MTH |
Referencias
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2095-2128 (2012).
- Kim, D. -. H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 565-570 (2010).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circulation Research. 109, 47-59 (2011).
- Bursac, N., Parker, K., Irvanian, S., Tung, L. Cardiomyocyte Cultures With Controlled Macroscopic Anisotropy: A Model for Functional Electrophysiological Studies of Cardiac Muscle. Circulation Research. 91, (2002).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).
- Stevens, M. M. Exploring and Engineering the Cell Surface Interface. Science. 310, (2005).
- Mark, K., Park, J., Bauer, S., Schmuki, P. Nanoscale engineering of biomimetic surfaces: cues from the extracellular matrix. Cell Tissue Res. 339, 131-153 (2009).
- Lü, J. -. M., Wang, X., Marin-Muller, C., Wang, H., Lin, P. H., Yao, Q., Chen, C. Current advances in research and clinical applications of PLGA-based nanotechnology. Expert. Rev. Mol. Diagn. 9, 325-341 (2009).
- Kim, H. N., et al. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Ann Biomed Eng. 40, 1339-1355 (2012).
- Kim, D. -. H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. Matrix nanotopography as a regulator of cell function. The Journal of Cell Biology. 197, 351-360 (2012).
- Park, J., Kim, H. -. N., Kim, D. -. H., Levchenko, A., Kahp-Yang, S. Quantitative Analysis of the Combined Effect of Substrate Rigidity and Topographic Guidance on Cell Morphology. IEEE Trans.on Nanobioscience. 11, 28-36 (2012).
- Kim, D. -. H., Lee, H., Lee, Y. K., Nam, J. -. M., Levchenko, A. Biomimetic Nanopatterns as Enabling Tools for Analysis and Control of Live Cells. Adv. Mater. 22, 4551-4566 (2010).
- Kim, D. -. H., Wong, P. K., Park, J., Levchenko, A., Sun, Y. Microengineered Platforms for Cell Mechanobiology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 203-233 (2009).
- Kim, D. -. H., et al. Nanopatterned cardiac cell patches promote stem cell niche formation and myocardial regeneration. Integr Biol. 4, 1019 (2012).
- Kim, P., et al. Fabrication of nanostructures of polyethylene glycol for applications to protein adsorption and cell adhesion. Nanotechnology. 16, 2420-2426 (2005).
- Hwang, S. Y., et al. Adhesion Assays of Endothelial Cells on Nanopatterned Surfaces within a Microfluidic Channel. Anal. Chem. 82, 3016-3022 (2010).
- Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the Future of Cardiovascular Disease in the United States: A Policy Statement From the American Heart Association. Circulation. 123, 933-944 (2011).
- Legrice, I. J., et al. Laminar structure of the heart: ventricular myocyte arrangement and connective tissue architecture in the dog. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 269, 1-12 (2002).
- Sosnovik, D. E., Wang, R., Dai, G., Reese, T. G., Wedeen, V. J. Diffusion MR tractography of the heart. J Cardiovasc Magn Reson. 11, 47 (2009).
- Bers, D. M. Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction. Circulation Research. 87, 275-281 (2000).
- Mohrman, D. E., Heller, L. J. . Cardiovascular Physiology. , (2010).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
- Zhang, J., et al. Functional Cardiomyocytes Derived From Human Induced Pluripotent Stem Cells. Circulation Research. 104, (2009).
- Qian, J. -. Y., Guo, L. Altered cytosolic Ca2+ dynamics in cultured Guinea pig cardiomyocytes as an in vitro model to identify potential cardiotoxicants. Toxicology in Vitro. 24, 960-972 (2010).
- You, M. -. H., et al. Synergistically Enhanced Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells by Culture on Nanostructured Surfaces with Induction Media. Biomacromolecules. 11, 1856-1862 (2010).
- Kim, H. N., et al. Nanotopography-guided tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 536-558 (2013).
- Mannix, R. J., et al. Nanomagnetic actuation of receptor-mediated signal transduction. Nature Nanotech. 3, 36-40 (2007).
- Karuri, N. W., et al. Biological length scale topography enhances cell-substratum adhesion of human corneal epithelial cells. J Cell Sci. 117, 3153-3164 (2007).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92, 2964-2974 (2007).
- Koo, L. Y., Irvine, D. J., Mayes, A. M., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G. Co-regulation of cell adhesion by nanoscale RGD organization and mechanical stimulus. J Cell Sci. 115, 1-11 (2002).
- Yim, E. K. F., et al. Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells. Biomaterials. 26, 5405-5413 (2008).
- Dalby, M. J., et al. The control of human mesenchymal cell differentiation using nanoscale symmetry and disorder. Nat Mater. 6, 997-1003 (2007).
- Park, J., Bauer, S., Mark, v. o. n. . d. e. r. . K., Schmuki, P. Nanosize and Vitality: TiO 2Nanotube Diameter Directs Cell Fate. Nano Lett. 7, 1686-1691 (2007).
- Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 92, 232-257 (2006).
- Tung, L., Zhang, Y. Optical imaging of arrhythmias in tissue culture. Journal of Electrocardiology. 39, (2006).
- Himel, H. D., Bub, G., Lakireddy, P., El-Sherif, N. Optical imaging of arrhythmias in the cardiomyocyte monolayer. Heart Rhythm. 9, 2077-2082 (2012).
- Kim, J., Hayward, R. C. Mimicking dynamic in vivo environments with stimuli-responsive materials for cell culture. Trends in Biotechnology. 30, 426-439 (2012).
- Henderson, D. J., Anderson, R. H. The Development and Structure of the Ventricles in the Human Heart. Pediatr Cardiol. 30, 588-596 (2009).
- Badie, N., Bursac, N. Novel Micropatterned Cardiac Cell Cultures with Realistic Ventricular Microstructure. Biophysj. 96, 3873-3885 (2009).
- Badrossamay, M. R., McIlwee, H. A., Goss, J. A., Parker, K. K. Nanofiber Assembly by Rotary Jet-Spinning. Nano Lett. 10, 2257-2261 (2010).
- Rao, C., et al. The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).
