Kapillar-Force-Lithographie für Herz-Tissue Engineering
Summary
In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.
Abstract
Herz-Kreislauf-Krankheit bleibt die führende Todesursache weltweit ein. Cardiac Tissue Engineering hält viel Versprechen, bahnbrechende medizinische Erkenntnisse mit den Zielen der Entwicklung von funktionalen Geweben für die Herzregeneration sowie in-vitro-Screening-Tests zu liefern. Allerdings hat die Fähigkeit, High-Fidelity-Modelle von Herzgewebe zu erzeugen schwierig erwiesen. Das Herz der extrazellulären Matrix (ECM) ist eine komplexe Struktur, bestehend aus beiden biochemischen und biomechanischen Signale im Bereich von der Mikro-bis Nanometerskala 2. Lokale mechanische Belastung und der Zell-ECM-Interaktionen wurden vor kurzem als wichtige Komponenten in der Herzgewebetechnik 3-5 anerkannt.
Ein Großteil des Herz ECM von ausgerichteten Kollagenfasern mit Durchmessern im Nanomaßstab, die Gewebearchitektur und elektromechanische Kupplung 2 maßgeblich beeinflusst besteht. Leider haben nur wenige Methoden have in der Lage gewesen, die Organisation der ECM-Fasern bis in den Nanometerbereich zu imitieren. Jüngste Fortschritte in der Nano Techniken haben jedoch die Konstruktion und Herstellung von skalierbaren Gerüste, die die in vivo strukturelle Steifigkeit und Substrat Signale des ECM im Herzen 6-9 imitieren aktiviert.
Hier die Entwicklung stellen wir zwei reproduzierbar, kostengünstig und skalierbar Nano Verfahren zur funktionellen Ausrichtung der Herzzellen mit dem biokompatiblen Polymer Poly (lactid-co-glycolid) (PLGA) 8 und ein Polyurethan (PU)-basierten Polymers. Diese anisotrop nanohergestellte Substrate (ANF) imitieren die zugrunde liegenden ECM gut organisiert, ausgerichtet Gewebe und kann verwendet werden, um die Rolle der Nanotopographie auf die Zellmorphologie und Funktion 14.10 untersuchen.
Mit Hilfe eines nanostrukturierten (NP) Silizium-Master als Vorlage wird eine Polyurethan-Acrylat (PUA) Form hergestellt. Diese PUA Form wird dann verwendet, pattern die PU-oder PLGA Hydrogel über UV-unterstützte oder Lösungsmittel-vermittelte Kapillarkraft Lithographie (CFL), bzw. 15,16. Kurz gesagt, PU-oder Pre-PLGA-Polymer-Fall auf einem Deckglas und der PUA Form wird auf die Spitze verzichtet. Für UV-unterstützte CFL, die PU wird dann mit UV-Strahlung (λ = 250-400 nm) zur Härtung ausgesetzt wird. Für Lösungsmittel-vermittelte CFL wird die PLGA mit Hitze (120 ° C) und Druck (100 kPa) eingeprägt. Nach dem Aushärten wird die Form PUA abgezogen und hinterließ eine ANF für die Zellkultur. Primärzellen wie neugeborenen Ratten Kardiomyozyten, sowie menschliche pluripotente Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen, kann auf der ANF 2 gehalten werden.
Introduction
Kardiovaskuläre Erkrankungen sind die häufigste Ursache für Morbidität und Mortalität in der Welt und stellen eine gewichtige sozioökonomische Belastung für eine bereits angespannte globale Gesundheitssystem 1,17. Cardiac Tissue Engineering hat zwei unterschiedliche Ziele: (1), um beschädigte Herzmuskel nach einem ischämischen Kardiomyopathie Krankheit oder regenerieren oder (2), um eine High-Fidelity-Modell des Herzens für die in vitro Wirkstoff-Screening oder Krankheit Modellierung zu erstellen.
Das Herz ist ein komplexes Organ, das ständig arbeiten muss, um Blut in den Körper zu versorgen. Dicht gepackte Schichtstrukturen von Kardiomyozyten und Stützgewebe werden in spiralförmigen Muster in der gesamten Herzwand 18,19 angeordnet. Das Herz wird auch elektromechanisch in einem sehr koordiniert, effizient Blut auswerfen, um den Körper 20 21 gekoppelt. Mehrere große Hürden angesprochen werden, jedoch vor komplizierten Design der Natur zuverlässig in vitro rekapituliert werden.Erste, wenn auch robust Kardiomyozytendifferenzierung Methoden weiterentwickelt werden 22, hpSC-CMs noch zeigen eher unreifen Phänotypen. Die elektromechanischen Eigenschaften und Morphologie am ehesten entsprechen fetalen Ebenen 23. Zweitens, wenn in der traditionellen Kulturbedingungen gehalten, sowohl Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen und Grund nicht, in native, gewebeartigen Strukturen zusammenzubauen. Vielmehr Zellen werden zufällig ausgerichtet und nicht die gebändert stabförmige Aussehen der Erwachsenenherzmuskel 24 aufweisen.
Die extrazelluläre Matrix (ECM), mit der Umgebung interagieren Zellen spielt eine wichtige Rolle bei zahlreichen zellulären Prozessen 11,13,25. Das ECM aus komplexen, gut definierte Molekular und topographischen Signale, die die Struktur und Funktion von Zellen 6,26 signifikant beeinflussen. Innerhalb des Herzens, sich eng an die zugrunde liegenden zellulären Ausrichtung Nanometerbereich ECM Fasern 2. Die Auswirkungen dieser nanotopographsche Signale auf Zell-und Gewebefunktion ist jedoch weit von vollständig verstanden. Voruntersuchungen der Nanometerskala zell Biomaterial Interaktion zeigen die potentielle Bedeutung und Auswirkung Submikrometerbereich topographischen Signale für Zellsignal 27, 28-30 Adhäsion, Wachstum 31 und Differenzierung 32,33. Jedoch aufgrund der Schwierigkeit bei der Entwicklung von reproduzierbaren und skalierbaren nanofabricated Substrate, wie Untersuchungen konnte die Multiskalen zellulären Effekte des Komplexes in vivo ECM-Umgebung zu reproduzieren. In diesem Protokoll wird ein einfacher und kostengünstiger Nanofabrikation Technik, um Zellkultur Gerüste imitiert nativen Herz ECM Faserausrichtung erzeugen beschrieben, so dass für eine breite Palette von neuen Untersuchungen von Kardiomyozyten-Biomaterial-Interaktionen. Verstehen, wie Kardiomyozyten interagieren mit dem nanoskaligen ECM-Umfeld konnte für die Fähigkeit, das Zellverhalten zu nativem Gewebe genauer nachahmen Funktionen steuern könnention. Darüber hinaus sind Zellmonoschichten eine vereinfachte Experimentalsystem im Vergleich zu 3D-Strukturen, aber immer noch komplexen mehrzelligen Verhalten für aufschlussreiche Untersuchungen und funktionelles Screening 2,34-36 aufweisen. Schließlich könnten solche Gerüste verwendet, um zelluläre Transplantatfunktion zu verbessern, wenn in das Herz für regenerative Zwecke 37 implantiert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Funktionell reifen Herzgewebe fehlen sowohl in vivo und in-vitro-Anwendungen von Herzgewebe Technik. Die hier beschriebenen Methoden sind CFL Nanofabrikation robuste Techniken zur Erreichung zelluläre Ausrichtung und Einfluss makroskopischen Gewebefunktion aufgrund der Skalierbarkeit des Systems. Große Flächen können einfach strukturiert und für die Zellkultur eingesetzt werden. Makroskopische zelluläre Ausrichtung ist notwendig, um biomimetische, funktionelles Gewebe, da sie sowohl mechanische u…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D. H. Kim thanks the Department of Bioengineering at the University of Washington for the new faculty startup fund. D. H. Kim is also supported by the Perkins Coie Award for Discovery, the Wallace H. Coulter Foundation Translational Research Partnership Award, the Washington State Life Science Discovery Fund, and the American Heart Association Scientist Development Grant (13SDG14560076). J. Macadangdang and A. Jiao thank the support from the NIH Bioengineering Cardiovascular Training Grant Fellowship. Additional support for this work comes from the National Institutes of Health (NIH) grant R01HL111197 to M. Regnier.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| NOA 76 | Norland Products, Inc. | 7606B | |
| Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) | Minuta Tech | ||
| PUA | Minuta Tech | MINS-311RM | |
| Soft Rubber Roller | Speedball | ||
| Silicon Wafers | NOVA Electronic Materials | FA01-9900 | |
| Photoresist | Shipley | SPRT510 | |
| Photoresist Developer | Shipley | MF320 | |
| Electron-Beam Lithography System | JEOL | JBX-9300FS | |
| Etching System | Surface Technology Systems | NP10 8UJ | |
| Plasma Asher System | BMR Technology Co. | DSF-200 | |
| Ozone Cure System | Minuta Tech | MT-UV-O- 08 | |
| Fusion Cure System | Minuta Tech | MT-UV-A 11 | |
| NOA 83H | Norland Products, Inc. | 8301 | |
| Spin Coater | Laurel Technology | WS-400-6NPP | |
| Skyrol PET Film | SKC Co., Ltd. | 23038-59-9 | |
| 25mm Glass Slides | Corning | 2948 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 6/5/2553 | |
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | P2191-1G | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978-1L | |
| 500g Weights | Global Insustrial | T9FB503120 | |
| Isopropyl Alcohol | EMD Millipore | PX1835-2 | |
| Hot Plate | Corning | PC-420D | |
| Sonicator | Branson | B2510MTH |
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