Capilar Força Litografia de Engenharia tecido cardíaco
Summary
In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.
Abstract
A doença cardiovascular continua a ser a principal causa de morte em todo o mundo 1. Engenharia de tecidos cardíacos muito promissora para entregar descobertas médicas inovadoras com os objectivos de desenvolvimento de tecidos funcionais para regeneração cardíaca, bem como ensaios in vitro de triagem. No entanto, a capacidade de criar modelos de alta fidelidade de tecido cardíaco tem sido difícil. Matriz extracelular do coração (ECM) é uma estrutura complexa composta de ambos os sinais bioquímicos e biomecânicos que variam a partir do micro-à escala nanométrica 2. Local condições de carga mecânica e interações célula-ECM foram recentemente reconhecidos como componentes vitais em engenharia de tecido cardíaco 3-5.
Uma grande parte do ECM cardíaco é composto por fibras de colágeno alinhados com diâmetros em escala nano que influenciam significativamente a arquitetura do tecido e acoplamento eletromecânico 2. Infelizmente, alguns métodos have foram capazes de imitar a organização das fibras de ECM para baixo para a escala nanométrica. Os recentes avanços em técnicas de nanofabricação, no entanto, permitiram o projeto e fabricação de andaimes escaláveis que imitam os sinais in vivo de rigidez estrutural e substrato do ECM no coração 6-9.
Aqui apresentamos o desenvolvimento de duas reprodutíveis, os processos de microusinagem escaláveis para o alinhamento funcional das células cardíacas usando o poli biocompatível polímero (ácido lático-co-glicólico) (PLGA) 8 e um poliuretano (PU) de polímero a base de custo-benefício, e. Estes substratos anisotropicamente nanofabricated (ANFS) imitar o ECM subjacente bem organizados, tecidos alinhados e pode ser utilizado para investigar o papel de nanotopografia na morfologia e função das células 10-14.
Usando um mestre de silício nanopatterned (NP), como um modelo, um acrilato de poliuretano (PUA) molde é fabricado. Este molde PUA é então utilizado para pattern o hidrogel PU ou PLGA via assistida por UV ou litografia força capilar mediada por solvente (CFL), respectivamente 15,16. Resumidamente, PU ou PLGA de pré-polímero é gota dispensada para uma lamela de vidro e o molde PUA é colocada em cima. Para CFL assistida por UV, a UP é então exposto à radiação ultravioleta (λ = 250-400 nm) para a cura. Para mediada por solvente CFL, o PLGA é gravado utilizando calor (120 ° C) e pressão (100 kPa). Após a cura, o molde PUA é retirado, deixando para trás um ANFS para cultura de células. Pilhas, como miócitos ventriculares de ratos neonatos, bem como cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes humanas, pode ser mantido no ANFS 2.
Introduction
A doença cardiovascular é a principal causa de morbidade e mortalidade no mundo e apresentar um peso sócio-econômico importante em uma 1,17 já tenso sistema de saúde global. Engenharia de tecidos cardíacos tem dois objetivos distintos: (1) para regenerar miocárdio danificado após doença isquêmica ou cardiomiopatia ou (2) para a criação de um modelo de alta fidelidade do coração para a triagem de drogas in vitro ou modelagem doença.
O coração é um órgão complexo que deve trabalhar constantemente para fornecer sangue para o corpo. Estruturas laminares densamente embalado de cardiomiócitos e tecidos de suporte são dispostos em padrões helicoidais em toda a parede do coração 18,19. O coração também é eletromecanicamente acoplada 20 em uma forma altamente coordenada para ejetar o sangue eficientemente para o corpo 21. Vários grandes obstáculos ainda precisam ser abordados, no entanto, antes de desenho intrincado da natureza pode ser reproduzido de forma confiável in vitro.Em primeiro lugar, embora os métodos de diferenciação de cardiomiócitos robustas continuam a ser desenvolvidos 22, HPSC-CMs ainda exibem fenótipos bastante imaturos. Suas propriedades eletromecânicas e morfologia mais se aproximam os níveis fetais 23. Em segundo lugar, quando mantidos em condições de cultivo tradicionais, tanto com células-tronco derivadas e cardiomiócitos primários não conseguem montar em, estruturas de tecido-como nativas. Pelo contrário, as células tornam-se orientadas aleatoriamente e não apresentam a aparência em forma de haste em faixas de miocárdio adulto 24.
O ambiente da matriz extracelular (ECM) com os quais interagem as células desempenha um papel importante em numerosos processos celulares 11,13,25. A ECM é composto por sinais moleculares e topográficos complexos, bem definidas, que influenciam de forma significativa a estrutura e função das células de 6,26. Dentro do coração, o alinhamento celular segue de perto as fibras ECM escala nanométrica subjacente 2. O impacto destes nanotopographpistas icas em células e a função do tecido, no entanto, está longe de ser completamente entendido. Estudos preliminares de interação célula-biomaterial escala nanométrica indicam a potencial importância eo impacto da sub-mícron sugestões topográficas para sinalização celular 27, adesão 28-30, crescimento de 31, e de diferenciação 32,33. No entanto, devido à dificuldade no desenvolvimento de substratos nanofabricated reprodutíveis e expansíveis, tais estudos podem não reproduzir os efeitos celulares multi-escala do complexo em ambiente de ECM in vivo. Neste protocolo, uma técnica de nanofabricação simples e de baixo custo para a produção de scaffolds de cultura celular que imita fibra de alinhamento ECM cardíaca nativa é descrito, permitindo uma ampla gama de novas investigações de interações cardiomiócitos-biomaterial. Entender como cardiomiócitos interagir com o ambiente ECM nanoescala pode permitir a capacidade de controlar o comportamento celular para mais de perto imitar func tecido nativoção. Além disso, as monocamadas de células são um sistema experimental simplificado em comparação com estruturas 3D, mas ainda apresentam um comportamento multicelular complexo para investigações criteriosas e triagem funcional 2,34-36. Finalmente, tais suportes pode ser usada para melhorar a função do enxerto celular quando implantado no coração para efeitos de regeneração 37.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tecidos cardíacos funcionalmente maduros faltam para tanto in vivo e in vitro em aplicações de engenharia de tecido cardíaco. Os métodos de nanofabricação CFL aqui descritas são técnicas robustas para alcançar o alinhamento celular e influenciando a função do tecido macroscópico devido à escalabilidade do sistema. Grandes áreas podem ser facilmente modelado e usado para a cultura de células. Alinhamento celular macroscópica é essencial em engenharia de tecido cardíaco, a fim de criar…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D. H. Kim thanks the Department of Bioengineering at the University of Washington for the new faculty startup fund. D. H. Kim is also supported by the Perkins Coie Award for Discovery, the Wallace H. Coulter Foundation Translational Research Partnership Award, the Washington State Life Science Discovery Fund, and the American Heart Association Scientist Development Grant (13SDG14560076). J. Macadangdang and A. Jiao thank the support from the NIH Bioengineering Cardiovascular Training Grant Fellowship. Additional support for this work comes from the National Institutes of Health (NIH) grant R01HL111197 to M. Regnier.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| NOA 76 | Norland Products, Inc. | 7606B | |
| Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) | Minuta Tech | ||
| PUA | Minuta Tech | MINS-311RM | |
| Soft Rubber Roller | Speedball | ||
| Silicon Wafers | NOVA Electronic Materials | FA01-9900 | |
| Photoresist | Shipley | SPRT510 | |
| Photoresist Developer | Shipley | MF320 | |
| Electron-Beam Lithography System | JEOL | JBX-9300FS | |
| Etching System | Surface Technology Systems | NP10 8UJ | |
| Plasma Asher System | BMR Technology Co. | DSF-200 | |
| Ozone Cure System | Minuta Tech | MT-UV-O- 08 | |
| Fusion Cure System | Minuta Tech | MT-UV-A 11 | |
| NOA 83H | Norland Products, Inc. | 8301 | |
| Spin Coater | Laurel Technology | WS-400-6NPP | |
| Skyrol PET Film | SKC Co., Ltd. | 23038-59-9 | |
| 25mm Glass Slides | Corning | 2948 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 6/5/2553 | |
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | P2191-1G | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978-1L | |
| 500g Weights | Global Insustrial | T9FB503120 | |
| Isopropyl Alcohol | EMD Millipore | PX1835-2 | |
| Hot Plate | Corning | PC-420D | |
| Sonicator | Branson | B2510MTH |
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