Proencefalo registrazione elettrofisiologica in larvale Zebrafish
Summary
Un metodo semplice per registrare potenziali di campo extracellulari nel proencefalo larvale zebrafish è descritto. Il metodo fornisce un robusto<em> In vivo</em> Lettura di sequestro un'attività simile. Questa tecnica può essere utilizzata con le larve di zebrafish geneticamente modificati portando epilessia geni correlati o convulsioni evocate dalla somministrazione di farmaci convulsivanti.
Abstract
L'epilessia colpisce circa 3 milioni di persone negli Stati Uniti e fino a 50 milioni di persone in tutto il mondo. Definito come il verificarsi di convulsioni non provocate spontanee, epilessia può essere acquisita a seguito di un insulto al cervello o una mutazione genetica. Gli sforzi per sequestri modello su animali hanno principalmente utilizzato acquisito insulti (farmaci convulsivanti, stimolazione o lesione cerebrale) e manipolazioni genetiche (atterramento antisenso, ricombinazione omologa o transgenesi) nei roditori. Zebrafish sono un sistema modello vertebrato 1-3 che potrebbe fornire una valida alternativa al roditore ricerca basata epilessia. Zebrafish sono ampiamente utilizzati nello studio dei vertebrati genetica o di sviluppo, presentano un elevato grado di somiglianza genetica ai mammiferi ed esprimere omologhi per ~ 85% di umani noti singolo gene mutazioni epilessia. A causa delle loro piccole dimensioni (4-6 mm di lunghezza), larve di zebrafish può essere mantenuta in volumi di fluido a partire da 100 pl durante lo sviluppo precoce e ARRAYED in multi-pozzetti. I reagenti possono essere aggiunti direttamente alla soluzione in cui gli embrioni sviluppano, semplificando la somministrazione del farmaco e consentendo un rapido screening in vivo di composti di prova 4. Oligonucleotidi sintetici (Morpholinos), mutagenesi, zinc finger nucleasi e approcci transgenici possono essere utilizzati per generare rapidamente knockdown gene o mutazione in zebrafish 5-7. Queste proprietà permettersi studi zebrafish senza precedenti analisi statistica vantaggio potere roditori nello studio di disturbi neurologici come l'epilessia. Poiché il "gold standard" per la ricerca l'epilessia è quello di monitorare e analizzare le scariche elettriche anomale che hanno origine in una struttura cerebrale centrale (ad esempio, convulsioni), un metodo per registrare in modo efficiente l'attività cerebrale in larvale zebrafish è descritto qui. Questo metodo è un adattamento dei tradizionali tecniche di registrazione extracellulari e permette stabile monitoraggio a lungo termine di attività cerebrale in larve di zebrafish intatto. Sregistrazioni ampie sono mostrate per crisi acute indotte da bagno applicazione di farmaci convulsivanti e sequestri spontanei registrati in un pesce geneticamente modificato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo di registrazione extracellulare qui presentata consente un'analisi molto sensibile e rapida di attività cerebrale. Queste registrazioni sono analoghi a elettroencefalografico (EEG) monitoraggio comunemente utilizzato per valutare la presenza di scarica elettrica anomala (cioè, sequestro) in modelli di roditori di epilessia 11 e 12 pazienti. Registrazioni extracellulari possono essere combinati con manipolazioni farmacologiche, come illustrato di seguito. Questi tipi di regi…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L'autore desidera ringraziare Peter Castro e Matteo Dinday per i loro primi sforzi per stabilire zebrafish in laboratorio. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health EUREKA sovvenzione (# R01NS079214-01).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | BP1360-100 | Dissolve in embryo media at 1.2% |
| Recording media | Fisher-Scientific | BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 | 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| α-bungarotoxin | Tocris Bioscience | 2133 | 1 mg/ml |
| Capillary glass tubing | Warner Instruments | G120TF-3 | Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
| Patch clamp amplifier | Warner Instruments | PC-505B | We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer’s instructions. |
| Filter/amplifier | Cygnus Technology | FLA-01 | We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer’s instructions. |
| Axon A/D board and Axoscope software | Molecular Devices | Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 | Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 kHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer’s instructions. |
| Egg water | Instant Ocean | 3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water |
Referencias
- Clark, K. J., et al. Stressing zebrafish for behavioral genetics. Reviews in Neuroscience. 22 (1), 49 (2011).
- Rinkwitz, S., et al. Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences. Progress in Neurobiology. 93 (2), 231 (2011).
- Penberthy, W. T., et al. The zebrafish as a model for human disease. Frontiers in Bioscience. 7, d1439 (2002).
- Letamendia, A., et al. Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings. PLoS One. 7, e36690 (2012).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216 (2000).
- Haffter, P., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line. Development. 123, 1 (1996).
- Suster, M. L., et al. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Molecular Biology. 561, 41 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Baraban, S. C., et al. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neurociencias. 131 (3), 759 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48 (6), 1151 (2007).
- Williams, P., et al. The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 39 (2006).
- Marsh, E. D., et al. Interictal EEG spikes identify the region of electrographic seizure onset in some, but not all, pediatric epilepsy patients. Epilepsia. 51 (4), 592 (2010).
- Zhu, C., et al. Evaluation and application of modularly assembled zinc-finger nucleases in zebrafish. Development. 138 (20), 4555 (2011).
