Met behulp van kwantitatieve real-time PCR voor donorcel Engraftment bepalen in een concurrerende Murine beenmergtransplantatie Model
Summary
Het bepalen van donorcel innesteling vormt een uitdaging in de muis beenmerg transplantatie modellen die goed gedefinieerde fenotypische merkers missen. We beschreven een methode om mannelijke donor cel innesteling te kwantificeren in vrouwelijke transplantatie ontvangende muizen. Deze methode kan worden gebruikt in alle muizenstammen voor de studie van HSC functies.
Abstract
Murine beenmergtransplantatie modellen een belangrijk instrument voor het meten van hematopoietische stamcellen (HSC) functies en het bepalen van genen / moleculen die HSCs reguleren. In deze modelsystemen transplantatie, wordt de functie van HSCs bepaald door het vermogen van deze cellen om enten en reconstitueren lethaal bestraalde ontvanger muizen. Gewoonlijk wordt de donorcel bijdrage / engraftment gemeten door antilichamen tegen donor-specifieke celoppervlakte-eiwitten met behulp van flowcytometrie. Deze werkwijze is sterk afhankelijk van de specificiteit en het vermogen van de celoppervlaktemarker tot donor-afgeleide cellen differentiëren van de ontvanger afkomstige cellen, die niet beschikbaar voor alle muizenstammen. Gezien de verschillende achtergronden van genetisch gemodificeerde muizenstammen in de markt, celoppervlak / flowcytometrie gebaseerde methode heeft vooral belangrijke beperkingen in muizenstammen die goed gedefinieerde oppervlaktemerkers gebrek aan afzonderlijke cellen van donor congenische ontvanger ceLLS. Hier rapporteerden we een PCR-gebaseerde techniek donorcel engraftment / bijdrage te bepalen in transplantatie ontvanger muizen. We getransplanteerd mannelijke donor beenmerg HSC om lethaal bestraalde congene vrouwelijke muizen. Perifere bloedmonsters werden verzameld op verschillende tijdstippen na transplantatie. Beenmerg monsters werden verkregen aan het eind van de experimenten. Genomisch DNA werd geïsoleerd en het Y-chromosoom specifiek gen, Zfy1, werd geamplificeerd met behulp van kwantitatieve real-time PCR. De innesteling van de mannelijke donor-afgeleide cellen in de vrouwelijke ontvangende muizen werd berekend met een standaard curve met bekende percentage mannelijke versus vrouwelijke DNA's. Bcl2 werd gebruikt als een referentie-gen van de totale hoeveelheid DNA normaliseren. Onze gegevens suggereren dat deze benadering betrouwbaar donorcel engraftment bepaald en een nuttig, maar eenvoudige werkwijze voor het meten van hematopoietische cellen in muizen reconstitutie beenmergtransplantatie modellen. Onze methode kan routinematig worden uitgevoerd in de meeste laboratoria omdat geendure apparatuur zoals flowcytometrie vereist.
Introduction
Murine beenmerg (BM) transplantatie model werd voor het eerst ontwikkeld in 1960 1. Dit model is uitgebreid toegepast voor de studie van donor hematopoietische stamcellen (HSC) biologie in een gastheer ontvanger muis. Murine beenmergtransplantatie model heeft ons voorzien van waardevolle kennis op HSC functies en hun regelgeving en is onmisbaar in HSC onderzoek. Allogene beenmergtransplantatie model zoals C57BL/6J H2b-Balb / C H2D of congene transplantatie model zoals C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 worden gebruikt in vele laboratoria om de genfunctie studeren op HSC activiteit 2, effect van drug behandeling HSC functie 3 of transplantatie gerelateerde ziekten zoals graft-versus-host disease (GvHD) 4.
Celoppervlaktemerkers zoals MHC haplotype of CD45.1 worden vaak gebruikt voor het onderscheiden van donor-afgeleide cellen van de ontvanger afkomstige cellen. C57BL/6J H2b, CD45.2 </sup>, Balb / C H2D en B6.SJL CD45.1 zijn de meest gebruikte muizenstammen in beenmergtransplantatie omdat de donorcel bijdrage kan gemakkelijk worden beoordeeld door flowcytometrie meten CD45.1 tegen CD45.2 of H2b vs H2D. Echter, veel andere stammen zoals FVB / NJ 5 en C3H ook vaak gebruikt om genetisch gemanipuleerde transgene of knock-out muizen te genereren. Deze muizen kunnen worden teruggekruist met een zuivere lijn en onderhouden in een gemengde genetische / MHC achtergrond. In deze gevallen kan bepalen donorcel innesteling en HSC functie moeilijk als donor-specifieke celoppervlaktemerkers niet beschikbaar.
Met behulp van Y-chromosoom-specifieke DNA-probe aan de donor mannelijke cellen te detecteren door Southern blot in seks-mismatched beenmergtransplantatie werd voor het eerst ontwikkeld door de groep Dr Miwa's 6. Vervolgens werd een real-time PCR voor het geslacht bepalend gebied Y gevonden dat nauwkeurige en zeer specifieke methode ma kwantificeren zijnle foetale cellen in het bloed van de moeder-systeem 7. Dit concept werd aangepast door Dr groep Schwarzenberger voor de ontwikkeling van een real-time PCR techniek in een murine beenmergtransplantatie model donorcel engraftment 8 bepalen. We verder gemodificeerd deze methode voor het meten van donorcel engraftment in FVB / NJ muis beenmergtransplantatie model. Deze methode wordt momenteel veelvuldig toegepast in onze groep voor het bestuderen van de rol van Pim1 kinase in HSC biologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van onze huidige studie is om het publiek een PCR-gebaseerde techniek om donorcel innesteling te kwantificeren in een concurrerende muis beenmergtransplantatie model. Verschillende studies gerapporteerd met RT-PCR met donor cellen te detecteren in transplantatiemodellen 9-10. Dr Schwarzenberger groep voor het eerst ontwikkeld een muizen beenmergtransplantatie model met behulp van real-time PCR voor het amplificeren van y-chromosoom-specifieke 8. Deze methode werd gebruikt om Gli-1 functie …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken dr. Charles Greenberg voor het gebruik van zijn real-time PCR-machine. Dit werk wordt ondersteund door MUSC Hollings Cancer Center opstarten Fonds, Hollings Cancer Center ACS IRG, ASCO Conquer Cancer Foundation Career Development Award, NIH 1K08HL 103780-01A1, en NIH 3P30CA138313-01S3. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health of andere financiering agenten.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30255.01 | |
| FBS | Invitrogen | 16140-017 | Heat inactivated |
| Ammonium chloride | MP Biomedicaals | 194806 | |
| Potassium Bicarbonate | Fisher | P184-500 | |
| QIAamp DNA Blood minikit | Qiagen | 51106 | |
| Cell strainer | BD bioscience | ||
| iQ SYBR Green supermix | Biorad | 170-8882 | |
| iQ5 real time PCR machine | Biorad | ||
| Spectra photometer | Nanodrop ND-1000 | ND-1000 |
Referencias
- McCulloch, E. A., Till, J. E. The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice. Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119, 4898-4907 (2012).
- Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model. PLoS One. 5, e11316 (2010).
- Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).
- Taketo, M., et al. FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).
- Morisaki, H., et al. Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation. Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).
- Lo, Y. M., et al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).
- Byrne, P., et al. Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR. Biotechniques. 32, 279-280 (2002).
- Ma, X., et al. Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation. PLoS One. 3, e1894 (2008).
- Bosio, E., et al. A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation. Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).
- Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors. Blood. 115, 2391-2396 (2010).
- Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues. Genes & development. 4, 63-74 (1990).
- Grundler, R., et al. Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration. J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).
