Cella Co-cultura Patterning Uso acquose due sistemi monofase

Summary

Acquose due sistemi monofase sono stati usati per simultaneamente popolazioni modello multiple di cellule. Questo metodo semplice e veloce per patterning cellulare sfrutta la fase di separazione di soluzioni acquose di destrano e polietilene glicole e la tensione interfacciale che esiste tra le due soluzioni polimeriche.

Abstract

Tecnologie di patterning cellulari che sono veloci, facili da usare e conveniente sarà necessario per il futuro sviluppo di saggi cellulari di throughput elevati, piattaforme per lo studio di interazioni cellula-cellula e sistemi di ingegneria tessutale. Questo protocollo dettagliato descrive un metodo per generare co-colture di cellule utilizzando soluzioni biocompatibili di destrano (DEX) e polietilene glicole (PEG) che di fase separata quando combinato sopra concentrazioni soglia. Cellule può essere modellato in una varietà di configurazioni con questo metodo. Esclusione patterning cella può essere eseguita stampando goccioline di DEX su un substrato e rivestimento con una soluzione di cellule contenenti PEG. La tensione interfacciale formato tra le due soluzioni polimeriche induce le cellule a diminuire verso l'esterno della goccia DEX e formare una radura circolare che può essere utilizzata per i saggi di migrazione. Isole di cellule può essere modellato erogando una cellula fase ricca DEX in una soluzione di PEG o coprendo il DEXgoccia con una soluzione di PEG. Co-colture possono essere formati direttamente dalla combinazione di esclusione delle cellule con patterning DEX isola. Questi metodi sono compatibili con una varietà di approcci manipolazione di liquidi, inclusi micropipetting manuale, e può essere utilizzato con qualsiasi tipo di cellule aderenti.

Introduction

Acquose di due sistemi monofase (ATPSs) forma quando le soluzioni di due polimeri incompatibili sono miscelati assieme a concentrazioni sufficientemente elevate. Separazione di fase è influenzata da una varietà di fattori che includono il peso molecolare e la polarità dei polimeri, temperatura, pH e soluzioni contenuto ionico del solvente acquoso ^{1, 2.} Il punto in cui viene determinato le due soluzioni di polimeri distinte dalle proprietà fisico del sistema fase prescelto, ma generalmente avviene a basse concentrazioni di polimero (meno del 20% peso / peso) sotto condizioni non denaturanti, permettendo ATPSs da utilizzare per la biotecnologia applicazioni ^3-9.

Di gran lunga i più studiati ATPS è il polietilene glicole (PEG) / destrano (DEX) sistema. Le ATPS formati da questi polimeri economici e biocompatibile è stato originariamente descritto per la purificazione di biomolecole mediante partizionamento molecolare ^{2, 10.} Partizionamentosi verifica quando le molecole aggiuntive o particelle che non contribuiscono al sistema di fase sono mescolati con PEG e DEX. Sulla base delle loro affinità relative sia per DEX o PEG, le molecole o le particelle sarà preferenzialmente trovarsi all'interno di una delle due fasi o all'interfaccia. Un'altra proprietà della PEG / DEX ATPS è l'esistenza di tensione interfacciale tra le due fasi polimeriche. ATPSs formate da PEG e DEX mostrano generalmente tensioni interfacciali che sono molto più basso rispetto agli altri liquido-liquido a due fasi di sistemi come l'olio e l'acqua, ma le forze di tensione di interfaccia ancora esercitare effetti su particelle di piccole dimensioni come i virus, le cellule e aggregati proteici ^{2 , 11-13.} Infine, poiché il peso molecolare più elevato e PEG DEX separato a basse concentrazioni (meno del 5% peso / peso di alta varietà polimeri peso molecolare) in presenza di concentrazioni fisiologiche di sali, ci sono pochi eventuali effetti deleteri sulle cellule di mammifero incorporato in questi sistemi^14-16.

Recentemente, le proprietà interfacciali e gli effetti di partizionamento ATPSs sono stati applicati dal nostro laboratorio per patterning cella ^{14, 16-20.} Ciò è stato realizzato micropatterning una soluzione densa DEX su substrati di coltura cellulare in presenza di PEG. Quando le cellule sono incorporati nella fase di PEG, sono escluse le goccioline di entrare DEX causa di PEG / DEX tensione interfacciale ^20. Quando le cellule sono modellati in fase di DEX, che vengono trattenuti sulla superficie del substrato di coltura cellulare da tensione interfacciale e partizionamento ^{16, 17, 19.}

A differenza di altri metodi di patterning cellulare, patterning cellulare ATPS è facile da imparare e richiede solo una conoscenza rudimentale sugli stessi polimeri, e la possibilità di effettuare la coltura cellulare e utilizzare una micropipetta. Altri metodi per patterning cellulare spesso coinvolgono attrezzature specializzate e di formazione che non sono facilmente tradotto in the scienze della vita. Ad esempio, alcuni metodi (microcontact stampa o stampa a getto d'inchiostro) cellule reticolo indirettamente applicando modelli di biomolecole adesive cellulari ad un substrato cultura che successivamente servire come siti per attaccamento cellulare ^{21, 22.} Sebbene approcci indiretti sono utili per alcuni tipi di cellule, che richiedono un alto grado di abilità dell'utente e attrezzature specializzate per fabbricare lo strumento patterning, e può mancano di specificità a seconda del particolare tipo di cellula / biomolecola pattern. In alternativa, le cellule possono essere depositati presso specificità modello alto per mezzo di approcci diretti patterning che includono flusso laminare patterning, stencil e la stampa a getto d'inchiostro ^23-26. Tuttavia, queste tecniche richiedono anche competenze dell'utente e attrezzature specializzate, e può danneggiare le cellule durante il processo di stampa. Sebbene questi approcci generalmente producono schemi precisi di cellule, per patterning cella per essere un utile strumento nelle scienze della vita, deve essere conveniente unand semplice da implementare.

Qui riportiamo un protocollo dettagliato per la generazione di colture cellulari a motivi geometrici utilizzando le ATPSs descritti nelle nostre applicazioni precedentemente pubblicate. Utilizzando micropipettatori solo, gli utenti possono generare zone di esclusione cellulari o isole di cellule per saggi di migrazione. Questo è ottenuto per mezzo di PEG / DEX tensione interfacciale che mantiene sia le cellule in fase di DEX o esclude cellule depositati nella fase PEG da DEX. Combinando queste due patterning tecniche fondamentali, è possibile generare rapidamente co-colture di cellule quali fibroblasti cellule epatiche-co-colture. Metodi di patterning, parametri ATPS e risultati attesi sono descritti in dettaglio.

Protocol

1. Fase di caratterizzazione del sistema: soglie che determinano la separazione delle fasi Preparare soluzioni contenenti PEG e DEX nel buffer desiderato o terreno di coltura cellulare come mostrato in Figura 1 (punti viola) in 15 ml o 50 ml provette coniche. D'ora in avanti, PEG e DEX farà riferimento a 35 PEG kDa e 500 kDa DEX, tuttavia, concentrazioni critiche cambierà a seconda dei due polimeri utilizzati. Registrare la massa di PEG e DEX in ciascuna soluzione. Ad alta concentrazion…

Representative Results

Per selezionare una combinazione appropriata di PEG e DEX per patterning cella è importante per determinare la curva binodal. Questa curva delinea i punti in cui si possono formare un ATPS e può variare per un dato insieme di polimeri a base di temperatura, pH e contenuto ionico. Per coltura di cellule che richiedono formulazioni personalizzate medio può essere necessario determinare sperimentalmente la curva binodal. Questo si ottiene generando una serie di ATPSs che sono lontani dal binodal e variando nel loro cont…

Discussion

Il metodo delle celle ATPS micropatterning richiede competenze molto poco al di là di idoneità all'uso di tecniche di coltura cellulare e può essere rapidamente padronanza. I vantaggi di questo sistema è che è poco costoso, rapido e compatibile con una varietà di tipi cellulari e formati coltura. Per queste ragioni, il nostro protocollo deve essere facilmente adottato dagli scienziati della vita, in particolare quelli che studiano la proliferazione cellulare, la migrazione e la chemiotassi, e l'influenza d…

Materials

Reagent	Manufacturer
Dextran 500,000 kDa	Pharmacosmos, Denmark
Polyethylene Glycol 35,000 kDa	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
Hela	ATCC, Manassas, VA
HepG2 C3A	ATCC, Manassas, VA
NIH 3T3	ATCC, Manassas, VA
Cell Tracker	Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM	Gibco, Carlsbad, CA
RPMI	Gibco, Carlsbad, CA
F12	Gibco, Carlsbad, CA
Fetal Bovine Serum	Gibco, Carlsbad, CA