في قياس الجسم الحي من الماوس الرئوي الطبقة السطحية غشائي
Summary
ودرس مثالي البطانية الطبقة السطحية الكنان السكري / البطانية باستخدام المجهر intravital. المجهر يمثل تحديا تقنيا Intravital في جهاز متحرك مثل الرئة. علينا أن نظهر كيف يمكن استخدام brightfield المجهري الفلورسنت في وقت واحد والبطانية لتقدير سمك الطبقة السطحية في الانتقال بحرية،<em> في الجسم الحي</em> الرئة الماوس.
Abstract
والكنان السكري البطانية هي طبقة من بروتيوغليكان والجليكوزامينوجليكان المرتبطة بطانة التجويف الأوعية الدموية. في الجسم الحي، والكنان السكري هو رطب للغاية، وتشكيل الطبقة السطحية كبيرة البطانية (ESL) التي تساهم في الحفاظ على وظيفة بطانة الأوعية الدموية. كما الكنان السكري في كثير من الأحيان البطانية الشاذة في المختبر، ويتم فقدان القياسية خلال تقنيات تثبيت الأنسجة، دراسة ESL يتطلب استخدام المجهر intravital. علم وظائف الأعضاء لأفضل تقريبي الجملة الوعائية المجهرية المعقدة للالسنخية، يتم تنفيذ مثالي التصوير intravital الرئوي على الرئة بحرية الحركة. هذه الاستعدادات، ومع ذلك، تعاني عادة من قطعة أثرية الحركة واسعة النطاق. علينا أن نظهر كيف يمكن استخدام مغلقة الصدر المجهر intravital من الرئة الماوس بحرية الحركة لقياس سلامة الكنان السكري عن طريق الاستبعاد من fluorescently ESL التي تحمل علامات عالية الوزن الجزيئي dextrans من سطح البطانية. هذه التقنية غير الجراحية الانتعاش، الأمر الذي يتطلبbrightfield في وقت واحد والتصوير الفلورسنت في الرئة الماوس، ويسمح للمراقبة الطولي للالجملة الوعائية المجهرية تحت الجنبة دون وجود أدلة على إحداث التباس إصابة الرئة.
Introduction
والكنان السكري البطانية هو طبقة من خارج الخلية بروتيوغليكان والجليكوزامينوجليكان المرتبطة بطانة الأوعية الدموية البطانية. في الجسم الحي، والكنان السكري هو رطب للغاية، وتشكيل الطبقة السطحية كبيرة البطانية (ESL) الذي ينظم مجموعة متنوعة من الوظائف بما في ذلك البطانية نفاذية السوائل 1، العدلات البطاني التصاق 2، وmechanotransduction من السوائل 3 إجهاد القص.
تاريخيا، كان الكنان السكري بالتقدير نظرا لضلال في الاستعدادات خلايا مستنبتة 4 و 5 و تدهورها خلال تثبيت الأنسجة القياسية وتجهيز 6. تزايد استخدام المجهر 7 من intravital (في الجسم الحي المجهري، IVM) وتزامن مع تزايد الاهتمام العلمي في أهمية ESL إلى وظيفة الأوعية الدموية أثناء الصحة والمرض. وESL غير مرئي إلى المجهر الضوئي ولا يمكن وصفها بسهولة فيفيفو، نظرا لنزوع يكتينس الكنان السكري ملزم الفلورسنت تسبب RBC تراص 8 و الصمات الرئوية المميتة (الملاحظات غير منشورة). ولذلك تم تطوير العديد من الأساليب غير المباشرة للاستدلال ESL سمك (، وبالتالي، الكنان السكري سلامة) في غير متحرك الأسرة الأوعية الدموية مثل microcirculations مشمري والمساريقي. هذه التقنيات تشمل قياس الاختلافات في تعميم سرعة microparticle بوصفها وظيفة من المسافة من غشاء بطانة (microparticle velocimetry صورة 9) وكذلك قياس استبعاد الضخمة التي تحمل علامات علامات fluorescently، الأوعية الدموية (مثل dextrans) من سطح البطانية (ديكستران تقنية استبعاد 10، 11). من هذه التقنيات، إلا ديكستران استبعاد قادر على تقدير ESL سمك من القياسات التي أجريت عند نقطة واحدة في الوقت المناسب. في وقت واحد من خلال قياس الاعراض الأوعية الدموية باستخدام المجهر brightfield (أ عرض فيclusive من ESL "غير مرئية") والمجهر الفلورسنت من التتبع الأوعية الدموية استبعادها من ESL، يمكن حساب سمك ESL ونصف الفرق بين الاعراض الأوعية الدموية 2.
استخدام إجراء فوري من سمك ESL هو مناسبة تماما للدراسة من الكنان السكري الرئوي. المجهر Intravital من الرئة هو أمر صعب، نظرا قطعة أثرية هامة الحركة الرئوي والقلبي. التطورات الحديثة في حين تسمح لتجميد الماوس الرئتين في الجسم الحي 12 و 13، تبقى المخاوف بشأن تأثير فيزيولوجي من ركود الرئة. ويرتبط الجمود الرئة مع انخفاض أكسيد النيتريك مما يشير البطانية 14، مما يشير إلى أن مسار يؤثر كل من التصاق الخلايا المتعادلة 15 و الرئة إصابة 16. وعلاوة على ذلك، تجميد مساحة الرئة يعرض المحيطة الحويصلات الهوائية المحمول لقوى القص الضارة (ما يسمى ب "atelectrauma")، وفقا للمفاهيم الكلاسيكية الفسيولوجية للالسنخية الترابط 17.
في عام 2008، وضعت اراتا Tabuchi، فولفغانغ كوبلر وزملاؤه تقنية جراحية السماح للفحص المجهري intravital من الرئة الماوس بحرية الحركة 18. يمكن تبطل قطعة أثرية الجهاز التنفسي الناجمة عن هذه التقنية باستخدام التصوير عالية السرعة، بما في ذلك قياس وقت واحد من brightfield المجهري والفلورية. في هذا التقرير، إلا أننا بالتفصيل كيف يمكن استخدام التصوير الفوري استبعاد ديكستران لقياس سمك ESL في دوران الأوعية الدقيقة تحت الجنبة من الرئة الماوس بحرية الحركة، في الجسم الحي. ويمكن تعديل هذه التقنية بسهولة لتحديد وظيفة الكنان السكري على وجه التحديد، فإن قدرة على حالها ESL لاستبعاد العناصر المنتشرة من سطح البطانية. وقد استخدمنا هذه التقنيات في الآونة الأخيرة لتحديد أهمية سلامة ESL الرئوي في تطوير إصابة الرئة الحادة الأمراض الالتهابية الجهازية خلال مثل الإنتان 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتزامن مع التوسع في استخدام المجهر في الجسم الحي، وهناك زيادة التقدير لحجم كل من كبير من ESL وكذلك مساهماته العديدة للعمل الأوعية الدموية. هذه البيانات الناشئة، ومع ذلك، تستمد أساسا من الدراسات من الأوعية الدموية الجهازية. في الواقع، واستخدام المجهر في الجسم ا…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكاترة. اراتا Tabuchi وولفغانغ كوبلر (جامعة تورنتو) للتعليم فيما يتعلق المجهر intravital. نشكر أندرو كاهيل (نيكون الآلات) للمساعدة في تصميم وتنفيذ المجهري. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NHLBI HL101295 P30 المنح وK08 HL105538 (لEPS).
Materials
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various |
Referencias
- Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung. AJP – Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).
- Florian, J. A., et al. Heparan sulfate proteoglycan is a mechanosensor on endothelial cells. Circ. Res. 93, e136-e142 (2003).
- Chappell, D., et al. The Glycocalyx of the Human Umbilical Vein Endothelial Cell: An Impressive Structure Ex Vivo but Not in Culture. Circulation Research. 104, 1313-1317 (2009).
- Potter, D. R., Damiano, E. R. The hydrodynamically relevant endothelial cell glycocalyx observed in vivo is absent in vitro. Circ. Res. 102, 770-776 (2008).
- Weinbaum, S., Tarbell, J. M., Damiano, E. R. The Structure and Function of the Endothelial Glycocalyx Layer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 121-167 (2007).
- Pittet, M., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Kilpatrick, D. C., Graham, C., Urbaniak, S. J., Jeffree, C. E., Allen, A. K. A comparison of tomato (Lycopersicon esculentum) lectin with its deglycosylated derivative. Biochem. J. 220, 843-847 (1984).
- Smith, M. L., Long, D. S., Damiano, E. R., Ley, K. Near-wall micro-PIV reveals a hydrodynamically relevant endothelial surface layer in venules in vivo. Biophys. J. 85, 637-645 (2003).
- Vink, H., Duling, B. R. Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries. Circ. Res. 79, 581-589 (1996).
- Marechal, X., et al. Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress. Shock. 29, 572-576 (2008).
- Presson, R. G., et al. Two-Photon Imaging within the Murine Thorax without Respiratory and Cardiac Motion Artifact. The American Journal of Pathology. 179, 75-82 (2011).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Meth. 8, 91-96 (2011).
- Pearse, D. B., Wagner, E. M., Permutt, S. Effect of ventilation on vascular permeability and cyclic nucleotide concentrations in ischemic sheep lungs. J. Appl. Physiol. 86, 123-132 (1999).
- Hossain, M., Qadri, S., Liu, L. Inhibition of nitric oxide synthesis enhances leukocyte rolling and adhesion in human microvasculature. Journal of Inflammation. 9, 28 (2012).
- Schmidt, E. P., et al. Soluble guanylyl cyclase contributes to ventilator-induced lung injury in mice. AJP – Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, L1056-L1065 (2008).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. J. Appl. Physiol. 28, 596-608 (1970).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J. Appl. Physiol. 104, 338-346 (2008).
- Gattinoni, L., Protti, A., Caironi, P., Carlesso, E. Ventilator-induced lung injury: the anatomical and physiological framework. Crit. Care Med. 38, 539-548 (2010).
- Tabuchi, A., Kim, M., Semple, J. W., Kuebler, W. M. Acute Lung Injury Causes Pendelluft Between Adjacent Alveoli In Vivo. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, A2490 (2011).
- Roebuck, K. A., Finnegan, A. Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression. J. Leukoc. Biol. 66, 876-888 (1999).
