La mesure in vivo de la surface de la couche de souris pulmonaire endothéliale
Summary
La couche de surface endothéliale glycocalyx / endothéliale est idéalement étudiées par microscopie intravitale. Microscopie intravitale est techniquement difficile dans un organe en mouvement, comme le poumon. Nous montrons comment fond clair simultanée et la microscopie à fluorescence peut être utilisée pour estimer endothéliale épaisseur de la couche de surface dans un mouvement libre-<em> In vivo</emPoumon de souris>.
Abstract
Le glycocalyx endothéliale est une couche de protéoglycanes et des glycosaminoglycanes associés qui tapissent la lumière vasculaire. In vivo, le glycocalyx est hautement hydraté, formant une couche de surface importante endothéliale (ESL) qui contribue au maintien de la fonction endothéliale. Comme le glycocalyx endothéliale est souvent aberrante in vitro et est perdue lors de standards techniques de fixation des tissus, l'étude de l'anglais langue seconde nécessite l'utilisation de la microscopie intravitale. Approcher au mieux la physiologie complexe de la microvascularisation alvéolaire, pulmonaire imagerie intravitale est idéalement réalisée sur un poumon librement en mouvement. Ces préparations, cependant, souffrent généralement d'un artefact de mouvement importante. Nous montrent comment à thorax fermé microscopie intravitale d'un poumon de souris librement mobile peut être utilisé pour mesurer l'intégrité glycocalyx par exclusion ESL de marquage fluorescent de haute masse moléculaire à partir de dextranes la surface endothéliale. Cette technique non reprise chirurgicale, qui nécessitefond clair simultanée et l'imagerie de fluorescence du poumon de souris, permet l'observation longitudinale de la microvascularisation subpleural sans preuve d'induire des lésions pulmonaires confusion.
Introduction
Le glycocalyx est une couche endothéliale extracellulaire de protéoglycanes et des glycosaminoglycanes associés qui tapissent le système vasculaire intima. In vivo, le glycocalyx est hautement hydraté, formant une couche de surface importante endothéliale (ESL) qui régule de nombreuses fonctions endothéliales, y compris la perméabilité aux fluides 1, neutrophiles-endothélial 2 adhérence, et la mécanotransduction de 3 contrainte de cisaillement du fluide.
Historiquement, le glycocalyx a été sous-estimée en raison de son aberrance dans des préparations cellulaires cultivées 4, 5 et sa dégradation pendant la fixation des tissus standard et de traitement 6. L'utilisation croissante 7 de microscopie intravitale (microscopie de vivo, l'IVM) a coïncidé avec un intérêt scientifique accrue de l'importance de l'ESL à la fonction vasculaire lors de santé et de maladie. L'ESL est invisible à la microscopie optique et ne peuvent pas être facilement étiquetéin vivo, compte tenu de la propension des fluorescents glycocalyx de liaison des lectines pour provoquer l'agglutination RBC 8 et embolie pulmonaire fatale (observations non publiées). Plusieurs approches indirectes ont donc été développées pour en déduire l'épaisseur ESL (et, par extension, de l'intégrité glycocalyx) en non-mobiles lits vasculaires tels que les microcirculations crémastérien et mésentériques. Ces techniques comprennent la mesure des différences dans la vitesse de circulation de microparticules en tant que fonction de la distance de la membrane endothéliale (vélocimétrie par images de microparticules 9) ainsi que la mesure de l'exclusion des encombrants à marquage fluorescent, des marqueurs vasculaires (par exemple les dextrans) à partir de la surface endothéliale (technique d'exclusion de dextrane 10, 11). Parmi ces techniques, seule l'exclusion dextrane est capable d'estimer l'épaisseur ESL partir de mesures faites à un moment précis dans le temps. En mesurant simultanément largeurs vasculaires en utilisant la microscopie en fond clair (d'une largeur deexclusive de la "invisible" ESL) et microscopie à fluorescence d'un traceur vasculaire exclus de l'ESL, ESL épaisseur peut être calculée comme la moitié de la différence entre les largeurs vasculaires 2.
L'utilisation d'une mesure instantanée de l'épaisseur de l'ESL est bien adapté pour l'étude du glycocalyx pulmonaire. Microscopie intravitale du poumon est difficile, étant donné la présence de mouvement significatif pulmonaire et cardiaque. Bien que les progrès récents permettent d'immobilisation des poumons de souris in vivo 12, 13, des préoccupations existent quant à l'impact physiologique du poumon stase. L'immobilité du poumon est associé avec l'oxyde nitrique endothélial diminué de signalisation 14, une voie de signalisation qui affecte à la fois l'adhésion des neutrophiles 15 et blessures pulmonaires 16. De plus, l'immobilisation d'une zone de poumon expose entourant alvéoles mobiles à des forces de cisaillement nuisibles (dite "atelectrauma"), conformément aux concepts classiques physiologiques del'interdépendance alvéolaire 17.
En 2008, Arata Tabuchi, Wolfgang Kuebler et ses collègues ont mis au point une technique chirurgicale qui permet pour la microscopie intravitale d'un poumon de souris librement mobile 18. Artefact respiratoire résultant de cette technique peuvent être annulés par l'utilisation de l'imagerie à haute vitesse, y compris la mesure simultanée de clair et microscopie à fluorescence. Dans ce rapport, nous détaillons la façon instantanée imagerie exclusion dextrane peut être utilisé pour mesurer l'épaisseur ESL dans la microcirculation sous-pleurale d'un poumon de souris librement se déplacer, in vivo. Cette technique peut être facilement modifié pour déterminer glycocalyx fonction-spécifiquement, la capacité d'une intact ESL pour exclure des éléments circulant à la surface endothéliale. Nous avons récemment utilisé ces techniques pour déterminer l'importance de l'intégrité ESL pulmonaire à l'élaboration d'une lésion pulmonaire aiguë au cours de maladies systémiques inflammatoires telles que la septicémie 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Coïncidant avec l'utilisation croissante de microscopie de vivo, on apprécie plus en plus à la fois pour la taille importante de l'ESL ainsi que ses nombreuses contributions à la fonction vasculaire. Ces nouvelles données, cependant, sont essentiellement issus des études de la vascularisation systémique. En effet, l'utilisation de la microscopie in vivo dans les poumons est techniquement difficile, étant donné artefact important mouvement pulmonaire et cardiaque. …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les Drs. Arata Tabuchi et Wolfgang Kuebler (Université de Toronto) pour l'enseignement en ce qui concerne la microscopie intravitale. Nous tenons à remercier Andrew Cahill (Nikon Instruments) pour l'assistance dans la conception et la mise en œuvre de microscopie. Ce travail a été financé par le NIH / NHLBI subventions P30 HL101295 et HL105538 K08 (pour EPS).
Materials
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various |
Referencias
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