Анализ целевой вирусного белка Наночастицы доставляется в HER2 + опухолей
Summary
В данной статье подробно процедуры для оптического анализа изображений с опухолью целевой наночастицы, HerDox. В частности, подробную информацию об использовании многомодового изображения устройства для обнаружения нацеливания на опухоль и оценки опухоли проникновение описан здесь.
Abstract
HER2 + опухолей целевых наночастиц, HerDox, экспонаты опухоли преимущественному накоплению и росту опухоли абляции в животной модели HER2 + рак. HerDox формируется нековалентными самосборки белка-мишени опухоли клетки с проникновением к препаратам, доксорубицин, через небольшой нуклеиновых линкер. Сочетание электрофильного, интеркаляции и олигомеризации облегчения взаимодействия самосборке в круглых частиц 10-20 нм. HerDox демонстрирует стабильность в крови, а также при длительном хранении при различных температурах. Системной доставки HerDox в опухоли мышей приводит к опухоли гибель клеток без заметного негативного воздействия на неопухолевых тканей, в том числе сердца и печени (которые подвергаются заметным повреждения нецелевой доксорубицин). HER2 высоте облегчает нацеливание на клетки, экспрессирующие человеческий рецептор эпидермального фактора роста, следовательно опухолей отображения повышенные уровни HER2 демонстрируют большему накоплению HerDox по сравнению с клетками экспрессиюпеть более низких уровнях, как в пробирке и в естественных условиях. Интенсивность флуоресценции в сочетании с конфокальной на месте и спектрального анализа позволило нам проверить в условиях Опухоль адресности и проникновения в опухоль клетки HerDox после системной доставки. Здесь мы подробно наши методы оценки нацеливания на опухоль с помощью многомодового изображений после системной доставки.
Introduction
Опухоль-таргетинга химиотерапии имеет потенциал, чтобы устранить раковые клетки при снижении дозы препарата по сравнению с нецелевым наркотики, потому что больше поставляемого терапия может накапливаться на ее назначению, а не распространять без опухолевой ткани. В последнем случае ослабит из эффективности препарата и, следовательно, требуют более высоких доз чтобы быть эффективным, опухоли-таргетинга имеет как терапевтические и безопасность преимущества по сравнению со стандартными нецелевой лечения.
Таргетинг химиотерапии инкапсуляции в самоорганизующихся наночастиц позволяет наркотиков остается химически не модифицированной в отличие от лекарств, которые ковалентно связаны с ориентацией молекул. В такой связи имеет потенциал, чтобы изменить действие как лекарственное средство, и целевой молекулы; нековалентному сборки позволяет активности лекарственных средств должны быть сохранены.
Ранее нами было показано, что новый трехкомпонентный, самоорганизующиеся комплекс, HerDox, цели HER2 + опухолей <em> В естественных условиях и вызывает рост опухоли абляции при щадящем нормальной ткани, в том числе сердца 1. HerDox формируется посредством нековалентных взаимодействий между связывания рецептора клеточной проникновение белка, HerPBK10 и химиотерапевтического агента, доксорубицин (доксорубицин), через небольшой нуклеиновых линкер. HerPBK10 связывает человеческий рецептор эпидермального фактора роста (HER) и запускает рецептор-опосредованного эндоцитоза 2-4, в то время как эндосомного проникновения мембраны осуществляют посредством включения аденовируса полученные Пентон база капсидного белка 4-6. Положительно заряженных домен белка обеспечивает нуклеиновую кислоту, 4 связывания, 5, через которые ДНК интеркалированного доксорубицин можно транспортировать для целевой доставки. Электрофильного, интеркаляции и, возможно, белковых взаимодействий олигомеризации способствовать самосборке в круглых частиц 10-20 нм, которые являются стабильными в крови и при длительном хранении при различных температурах 1. Льготные ориентации на HER2 + опухолевых клеток способствует повышенным сродством лиганда при HER2 повышается.
Наши предыдущие исследования показали, что системная доставка HerDox выходы преимущественному накоплению в опухоли по сравнению с не-опухолевой ткани и по сравнению с нецелевой Dox 1, и проникновение в опухолевые клетки в естественных условиях 7. Мы заметили, что HerDox релизы Dox после вступления клетки опухоли, что позволяет Dox накопления в ядро 1. Опухоль-видимому, накопление коррелирует с рецептором уровне, а относительно низкие HER2 опухолей, экспрессирующих HerDox накапливают меньше по сравнению с теми сравнительно высоким уровнем HER2 1. Кроме того, эффективная концентрация гибели клеток показывает обратную корреляцию с HER2 дисплей на опухолевые клеточные линии, экспрессирующие различные поверхности клетки HER2 уровня 1. HerDox обладает терапевтическими и безопасность преимущество перед нецелевой Dox, как опухолевые убийство происходит в более чем в 10 раз более низкой дозе по сравнению с распакуйтеgeted препарата и не дает обнаружить отрицательное воздействие на сердце (обнаружен с помощью эхокардиографии и гистологические пятна) или печени (обнаружен TUNEL пятно) ткани, в отличие от нецелевой доксорубицин 1. Несмотря на свое происхождение от вирусных белков капсида, HerPBK10 не проявляет иммуногенность обнаруживаемых на терапевтических уровнях 2. В то время как уже существующие антитела к целому аденовирус может распознать HerPBK10, они не в состоянии предотвратить связывание клеток 2.
Объем опухоли измеренная в течение долгого времени является стандартным методом оценки терапевтической эффективности целевой терапии, и была использована для оценки терапевтической эффективности HerDox. Дополнение этот подход с в естественных условиях и бывших естественных условиях интенсивность флуоресценции изображение позволило нам лучше оценить эффективность адресности 7. Мы специально интегрирован на месте конфокальной микроскопии вырезали опухоль со спектральным анализом ДОХ флуоресценции, чтобы убедиться, что нет HerDoxT только накопленная при опухолях в естественных условиях, но проникли в опухолевые клетки и доставлен Dox в цитоплазме и ядре 7. Спектральный анализ того позволило нам отличить Dox флуоресценции аутофлюоресценция 7.
Здесь мы показываем, более подробно наш подход к оценке HerDox в естественных условиях после системной доставки, и, самое главное, для оценки ориентации через многомодовых методов визуализации и анализа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dox флуоресценция может быть обнаружена в естественных условиях использования многомодового Imager, когда подкожные опухоли. Тем не менее, терапевтически эффективной дозы HerDox (0,004 мг / кг) ниже порога обнаружения после однократной дозы. В противоположность этому, после 7 ежедневных инъ…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась грантами для ЛКМ-K от Национального института здоровья / Национальный Институт Рака (R01CA129822 и R01CA140995). Доктор Медина-Kauwe спасибо C. Rey, М. М-Kauwe и Д. Revetto за постоянную поддержку.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fluorescence laser scanning confocal microscope | Leica | SPE | |
| In Vivo Optical Imager | Spectral Molecular Imaging | Multimode In Vivo Optical Imager | |
| Doxorubicin-HCl | Sigma-Aldrich | D4035 | |
| Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week | Charles River | Strain code 088 | |
| MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells | NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository | 0507292 | |
| 3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2″ Ultra-FineIV permanently attached needle | BD | 309301 | |
| Delta T chamber | Bioptechs | 04200417B |
Referencias
- Agadjanian, H., Chu, D., et al. Chemotherapy Targeting by DNA Capture in Viral Protein Particles. Nanomedicine. 7 (3), 335-352 (2012).
- Agadjanian, H., Ma, J., et al. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (15), 6105-6110 (2009).
- Agadjanian, H., Weaver, J. J., et al. Specific delivery of corroles to cells via noncovalent conjugates with viral proteins. Pharm. Res. 23 (2), 367-377 (2006).
- Medina-Kauwe, L. K., Maguire, M., et al. Non-viral gene delivery to human breast cancer cells by targeted Ad5 penton proteins. Gene Therapy. , 81753-81761 (2001).
- Medina-Kauwe, L. K., Kasahara, N., et al. 3PO, a novel non-viral gene delivery system using engineered Ad5 penton proteins. Gene Therapy. , 8795-8803 (2001).
- Rentsendorj, A., Xie, J., et al. Typical and atypical trafficking pathways of Ad5 penton base recombinant protein: implications for gene transfer. Gene Ther. 13 (10), 821-836 (2006).
- Hwang, J. Y., Park, J., et al. Multimodality Imaging In vivo for Preclinical Assessment of Tumor-Targeted Doxorubicin Nanoparticles. PLoS ONE. 7 (4), e34463 (2012).
- Hwang, J. Y., Wachsmann-Hogiu, S., et al. A Multimode Optical Imaging System for Preclinical Applications In Vivo: Technology Development, Multiscale Imaging, and Chemotherapy Assessment. Mol. Imaging Biol. , (2011).
- Hwang, J. Y., Gross, Z., et al. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. J. Biomed. Opt. 16 (6), 066007 (2011).
- Fujimoto, J. G., Farkas, D. L. . Biomedical Optical Imaging. , (2009).
- Hwang, J. Y., Moffatt-Blue, C., et al. Multimode optical imaging of small animals: development and applications. Proc. of SPIE. 6411, (2007).
- Ducros, M., Moreaux, L., et al. Spectral unmixing: analysis of performance in the olfactory bulb in vivo. PLoS One. 4 (2), e4418 (2009).
- Zimmermann, T. Spectral imaging and linear unmixing in light microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. , 95245-95265 (2005).
