La mise en œuvre Clamp dynamique avec conductances synaptiques et artificielle chez la souris cellules ganglionnaires rétiniennes
Summary
Cet article de la vidéo illustre la mise en place, les procédures de patcher les corps cellulaires et la façon de mettre en œuvre les enregistrements de serrage dynamiques à partir de cellules ganglionnaires dans l'ensemble du montage souris rétines. Cette technique permet l'étude de la contribution précise des entrées synaptiques excitateurs et inhibiteurs, et leur importance relative et le calendrier de dopage neuronale.
Abstract
cellules ganglionnaires sont les neurones de sortie de la rétine et leur activité reflète l'intégration de multiples entrées synaptiques découlant de circuits neuronaux spécifiques. techniques de patch-clamp, en pince tension et configurations de blocage actuels, sont couramment utilisées pour étudier les propriétés physiologiques des neurones et de caractériser leurs entrées synaptiques. Bien que l'application de ces techniques est très instructif, ils posent diverses limitations. Par exemple, il est difficile de quantifier les interactions précises des entrées excitateurs et inhibiteurs de déterminer sortie de réponse. Pour résoudre ce problème, nous avons utilisé la technique modifiée en cours de serrage, pince dynamique, aussi appelée conductance pince 1, 2, 3 et examiné l'impact des entrées synaptiques excitateurs et inhibiteurs sur l'excitabilité neuronale. Cette technique nécessite l'injection de courant dans la cellule et dépend de la rétroaction en temps réel de son potentiel de membrane à l'époque. Le injected actuel est calculé à partir des conductances prédéterminées synaptiques excitatrices et inhibitrices, leurs potentiels d'inversion et le potentiel de membrane de la cellule instantanée. Des détails sur les procédures expérimentales, timbre cellules de serrage pour obtenir une configuration cellule entière et l'emploi de la technique du clamp dynamique sont illustrés dans cet article de la vidéo. Ici, nous montrons les réponses des cellules ganglionnaires de la rétine de souris pour diverses formes d'onde de conductance obtenues à partir d'expériences physiologiques dans des conditions de contrôle ou à la présence de drogues. En outre, nous montrons l'utilisation des conductances excitateurs et inhibiteurs artificiels générés en utilisant les fonctions alpha pour étudier les réponses des cellules.
Introduction
La rétine est un tissu neural quasi-transparente qui tapisse le fond de l'œil. De nombreuses études utilisent la rétine comme modèle pour étudier les premières étapes de traitement visuel et les mécanismes de signalisation synaptiques. Puisque le réseau rétinien dans toute la préparation de montage reste intact après la dissection, il représente un système idéal pour étudier les interactions synaptiques que ses réponses physiologiques sont très similaires à la conditions in vivo. Ainsi, en utilisant une rétine isolée les propriétés de ses neurones peuvent être étudiés en utilisant des techniques de patch-clamp (pour les commentaires sur la technique, voir 6,9,13). Identification de la contribution exacte des circuits et des neurotransmetteurs à la réponse des cellules ganglionnaires spécifiques, cependant, est souvent entravée comme agents pharmacologiques agissent sur différents sites.
Réactions physiologiques des neurones de la rétine à la lumière, la stimulation naturelle, peuvent être enregistrés avec des pipettes en verre remplis de liquide intracellulaire. L'utilisation du patch cltechniques d'amplis, des réponses neuronales à la stimulation lumineuse peuvent être enregistrés en tant que membrane fluctuations potentielles (pince de courant) ou les courants (voltage clamp). En maintenant le potentiel de la membrane à des tensions différentes et la mise en oeuvre d'une analyse a posteriori de conductance, il est possible d'isoler des entrées synaptiques inhibiteurs et excitateurs 5,12. Ce type d'expériences peut être effectuée dans un milieu de bain normale et en présence de différents agents pharmacologiques d'isoler la contribution de différents neurotransmetteurs et les récepteurs à des réponses neuronales. Un grand nombre d'études de nombreux laboratoires caractérise la dépendance de la production et des intrants de dopage excitateurs et inhibiteurs sur les propriétés de relance telles que la taille, le contraste, les fréquences spatiales et temporelles, la direction, l'orientation et d'autres variables de relance. Bien que ces approches expérimentales fournissent des informations sur la relation entre la production et la flambée des entrées synaptiques en fonction des propriétés de stimulation,interprétation de la contribution de types cellulaires spécifiques et leurs entrées synaptiques à l'excitabilité de la cellule n'est pas simple. Cela est dû au fait que les intrants généralement à la fois excitateurs et inhibiteurs varient en fonction des propriétés de stimulation et donc, il n'est pas possible d'évaluer avec précision l'impact que les changements dans l'une de ces entrées possède le dopage neuronale.
Une approche alternative pour contourner ces limitations est d'effectuer des enregistrements de serrage dynamiques, qui permettent une évaluation critique de la contribution des entrées synaptiques individuels pour dopage sortie. La technique du clamp dynamique permet une injection directe du courant dans la cellule et la quantité de courant injecté à un moment donné dépend du potentiel de membrane enregistré à ce moment 1,2,3 (pour revue, voir 7,14). Il s'agit d'une pince en cours de modification mis en place lorsque, une interaction de rétroaction rapide en temps réel entre la cellule dans l'enregistrement et l'appareil comprenant un matériel spécialisé, le logicielet un ordinateur est atteint. La quantité de courant injecté dans la cellule est calculée en conséquence. Par conséquent, l'avantage de cette méthode est que la cellule peut être stimulée avec différentes combinaisons de formes d'onde de conductance, et sa réponse imitera l'activation des récepteurs qui interviennent entrées synaptiques. Par exemple, la comparaison de la réponse à l'injection de conductances excitateurs et inhibiteurs pour une petite tache de la réponse à l'injection de conductance excitatrice pour un petit point seulement fournit des informations sur l'impact de l'inhibition de la réponse cellulaire. De même, d'autres combinaisons de conductances physiologiquement enregistrées peuvent être co-injectée de révéler comment les changements dans conductances excitatrices et / ou inhibitrices stimulus dépendant affecte sortie pic.
Dans notre étude, la technique du clamp dynamique est utilisée pour démontrer l'impact de l'amplitude relative et le calendrier des entrées synaptiques sur les propriétés de cuisson des cellules ganglionnaires de la rétine. Divers conductancesobtenue à partir d'expériences physiologiques dans des conditions de contrôle, ou en présence d'agents pharmacologiques ont été employés en tant qu'entrées. En outre, la conductance artificiels basés sur les fonctions alpha ont également été utilisés afin d'étudier comment les entrées synaptiques sont intégrées par les neurones. Il s'agit donc d'une technique polyvalente qui permet différents types de conductance générés soit physiologiquement, pharmacologique ou de calcul doit être injecté dans la même cellule ganglionnaire, donc la comparaison des réponses à ces entrées peut être faite.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous montrons l'utilisation de la pince dynamique pour évaluer l'influence du rapport et de la synchronisation de l'excitation et l'inhibition de la production de cellules ganglionnaires de la rétine. Clamp dynamique rend l'utilisation de simulations informatiques pour introduire conductances synaptiques physiologiquement enregistrées ou artificielle dans les neurones vivants. Cette méthodologie fournit un outil interactif qui conductances peuvent être modifiés et injectés dans les neuron…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par le Conseil australien de la recherche (ARC DP0988227) et la science Biomedical Research Initiative Grant de la discipline des sciences biomédicales, Université de Sydney. L'équipement patch clamp amplificateur EPC 8 a été financée par le Fonds de démarrage de la discipline des sciences biomédicales, Université de Sydney. Le InstruTECH LIH 8 +8 système d'acquisition de données équipement a été acheté avec les fonds de la Fondation Cooper Rebecca L. et du Fonds de démarrage de la discipline des sciences biomédicales, Université de Sydney. Nous tenons à remercier les relecteurs anonymes pour leurs précieuses suggestions et commentaires.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflurane Inhalation Anaesthetic | Pharmachem | ||
| Ames Medium with L-Glutamate (Powder) | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Gluconate, Anhydrous | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES Sodium salt | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride solution (4.9 mol/l) | Sigma-Aldrich | ||
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | ||
| Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml) | Invitrogen | ||
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml | Invitrogen | ||
| Fluorescent Preserving Media | BioFX Laboratories Inc. | ||
| Equipment | |||
| Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm) | Warner Instruments | 64-0794 | |
| Single Stage Glass Microelectrode Puller | Narishinge Japan | Model PP-830 | |
| Minipuls 2 | Gilson | ||
| Millex-GV 0.22 μm Filter Unit | Millipore Corporation | SLGV004SL | |
| Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G | Smith & Nephew (Australia) | ||
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | Model SH-27B | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Olympus Stereomicroscope SZ61 | Olympus Corporation | ||
| Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective | Olympus Corporation | ||
| 0-30 V 2.5 A DC Power Supply | Dick Smith Electronics | Q1770 | |
| Digital Microscopic Camera ProgResMF cool | Jenoptik | ||
| Micromanipulator MP-225 | Sutter Instrument Company | ||
| Patch Clamp Amplifier EPC 8 | HEKA Elektronik | ||
| InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System | HEKA Elektronik | ||
| Computer: DELL | Dell Corporation |
Referencias
- Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).
- Sharp, A. A., O’Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).
- Sharp, A. A., O’Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).
- Johnson, D., Wu, S. M. -. S. . Foundations of cellular neurophysiology. , (1995).
- Taylor, W. R., Vaney, D. I. Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina. Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).
- Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. The patch clamp technique in ion channel research. Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).
- Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).
- Williams, S. R. Spatial compartmentalization and functional impact of conductance in pyramidal neurons. Nature Neuroscience. 7 (9), 961-967 (2004).
- Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
- Feng, S. S., Jaeger, D. The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study. Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).
- Butera, R., Lin, R., Destexhe, A., Bal, T. Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series. Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience. 1, (2009).
- Marco, S. D. i., Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation. The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).
- Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).
- Lobb, C. J., Paladini, C. A. Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique. J. Vis. Exp. (46), e2275 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).
- Middleton, T. P., Protti, D. A. Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells. Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).
- Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina. J. Vis. Exp. (57), e3457 (2011).
