שימוש<em> בvivo</em> הדמיה למעקב אחר ההתקדמות של זיהום ציטומגלווירוס עכבר ניסיוני בילודים
Summary
ציטומגלווירוס זיהום (HCMV) אנושי של ילודים מייצג גורם חשוב של פיגור שכלי, אולם האירועים המולקולריים המובילים להיווצרות מחלה הנגרמת וירוס עדיין הם הבינו היטב. כדי לחקור את הדינמיקה של דלקת המוח, התאמנו כל הבעלים החיים<em> In vivo</em> הדמיה לביצוע ניתוח בזמן קורס של ילודים נגועים בוירוס לוציפראז-רקומביננטי.
Abstract
ציטומגלווירוס האנושי (או HCMV HHV-5) הוא מחולל מחל מסכנת חיים בחיסון אנשים שנפרצו. עם זיהום מולד או ילוד, הווירוס יכול להדביק ולשכפל במוח המתפתח, אשר עלול לגרום לניזק נוירולוגים חמור, כולל חירשות ופיגור שכלי. למרות החומרה הפוטנציאלית של התסמינים, האפשרויות הטיפוליות מוגבלות על ידי חוסר הזמינות של חיסון והעדר טיפול אנטי ספציפי. יתר על כן, תיאור מדויק של אירועים המולקולריים המתרחשים במהלך הזיהום של מערכת העצבים המרכזית (CNS) הוא עדיין חסר מאז תצפיות נובעות בעיקר מהנתיחה שלאחר המוות של ילדים נגועים. כמה מודלים של בעלי חיים, כגון CMV רזוס מקוק, פותחו וסיפק תובנה חשובות בפתוגנזה CMV של מערכת העצבים המרכזית. עם זאת, למרות הקרבה האבולוציונית שלו עם בני אדם, מודל זה היה מוגבל על ידי הליך החיסון תוך גולגולתי משמש כדי להדביק את החיות וחסרונותistently לגרום לזיהום מערכת העצבים המרכזית. יתר על כן, שיקולים אתיים קידמו את הפיתוח של מודלים חלופיים, ביניהם זיהום בילוד של עכברי בני יומם עם עכבר ציטומגלווירוס (MCMV) הוביל לאחרונה להתקדמות משמעותית. לדוגמה, דווח כי זריקת intraperitoneal של MCMV לילודי Balb / ג מובילה לזיהום של תאי עצב ותאי גלייה באזורים מסוימים במוח. ממצאים אלו הראו כי חיסון ניסיוני של עכברים עשוי לסכם את הגירעונות הנגרמים על ידי זיהום HCMV בילדים. עם זאת, ניתוח דינמי של זיהום MCMV של ילודים הוא קשה לביצוע, כי המתודולוגיה קלסית דורשת הקרבה של מספר לא מבוטל של בעלי חיים בנקודות זמן שונים על מנת לנתח את נטל ו / או פרמטרים הקשורים לחיסון הנגיפי. כדי לעקוף את צוואר הבקבוק הזה ולאפשר לחקירות עתידיות של בעלי חיים שעברו מוטציה נדירות, אנחנו מוחלים in vivo הדמיה הטכנולוגיה כדי לבצע ניתוח בזמן קורס של Viraהפצת L במוח על הזרקה היקפית של MCMV רקומביננטי להביע לוציפראז לC57BL / 6 ילודים.
Introduction
ציטומגלווירוס האנושי (HCMV/HHV-5) הוא חבר של משפחת β-ההרפס. HCMV היא הפתוגן שכיח ביותר, אופורטוניסטי שהוא בדרך כלל שנרכש במהלך חייו המוקדמים כזיהום ללא תסמינים 1. כמו כל herpesviruses, HCMV נמשכת לאורך כל חייו של המארח שמערכת חיסון חזק שולטת שכפול נגיף. פרקים של הפעלה מחדש נגיפית בעיקר להתרחש אצל אנשים מדוכאי חיסון, כגון חולים להשתלה מקבלים תרופות למניעת דחיית שתל 2. אצל מבוגרים, HCMV גם קשורה לglioblastomas 3. בנוסף, HCMV היא הפתוגן בולט עבור תינוקות עם חסינות בשלה 4-6. הדבקה ראשונית בעובר או ילוד הפיתוח יכולה להיות השלכות חמורות. HCMV זיהום הוא הסיבה זיהומית הנפוצה ביותר של מומים מולדים מולדים והפרעות ילדות במדינות מפותחות. ההערכה היא כי השכיחות של זיהום HCMV ילוד משפיעה על 0.5-1% oF כל הלידה חי בין 5-10% שיסבלו מתסמינים חמורים כגון microcephaly או hypoplasia המוח הקטן. בנוסף, 10% מהתינוקות שנדבקו בזיהום נגיפי תת קליני יהיו מאוחר יותר לפתח sequellae מוביל לפיגור שכלי, אובדן שמיעה, ליקויים חזותיים או התקף אפילפסיה ו7,8.
בניגוד לherpesviruses אדם אחר כגון הרפס סימפלקס 1 (HSV-1/HHV-1) אשר ניתן לעכברים מחוסן דרך נתיבים של הזרקה 9 שונים, שכפול ציטומגלווירוס הוא מינים ספציפיים. תכונה זו פגעה קשה בחקירות של פתוגנזה HCMV אשר בוצעו במודלים של בעלי חיים שונים (עכבר, חולדה, חזיר, קוף רזוס) וCMVs מארח הספציפי האמיתי שלהם. כל CMVs מפגין דמיון משמעותי בגודל הגנום וארגון, כמיהות רקמות ורגולציה של ביטוי גנים. הם גם לגרום למחלות דומות במארח שלהם, בהתאמה. למרות גיוון גנטי להיותTween HCMV וציטומגלווירוס העכבר (MCMV) (50% מORFs להציג בוירוס האנושי מזוהים בCMV העכברי), מודל העכבר הוכיח לאחרונה להיות יתרון, בעיקר משום שניתן לבדוק זנים מוטנטים ליכולת שלהם לשלוט ויראלי שכפול in vivo. זה הוביל למסך גנטי שאפשרו הערכה של מספר הגנים עכבר לידי ביטוי בשלב הבוגר המרכיבים את "resistome" לווירוס הזה 10. בסך הכל, זה מצביע על כך MCMV עכברים נגועים מייצגים מודל אטרקטיבי לחקר אינטראקציות בין מאכסן לוירוס במבוגרים. החקירה של זיהום CMV מולד היא מורכבת יותר בגלל הבדלים בארגון שכבת שליה בין אדם ועכברים לפגוע בשידור אם לעובר של זיהום ויראלי בעכברים. לאחרונה, הזרקה ישירה של MCMV בשליה ביום 12.5 להריון אפשרה זיהום המוח של ילודים עכברים שהביאו לליקוי שמיעת 11. עם זאת, רובnvestigations כעת להשתמש בזריקת intraperitoneal של 4-20 ילודים בני שעה כדי לספק הפצה נגיפית מערכתית שעלולים לגרום לדלקת מוח hematogenous, מודל שהוא יותר רלוונטי מזו של הזרקה תוך גולגולתי. פרוטוקול זה סיפק תובנה חשובות פתוגנזה CMV ועוד במיוחד, זה הודגם כי זיהום MCMV של תוצאות יילודים בשכפול נגיף בתאים עצביים וגליה נמצאים במוקדים דלקתיים אשר חדרו עם תאי mononuclear כמו מקרופאגים 12. דו"ח זה גם תאר המורפוגנזה שינתה של המוח הקטן מלווה עם התפשטות פחת פרטנית נוירון והגירה והאינדוקציה של גני אינטרפרון מגורה מרובים. התפקיד החיוני של CD8 + תאי T לשליטת MCMV במערכת העצבים המרכזית שדיווח גם על ידי אותה הקבוצה 13. היבט חשוב לשקול בעת ניתוח ההשפעה פתולוגית של חיידק הוא את הדינמיקה של להדביקיון. במקרה של MCMV, זה חיוני במיוחד כדי לחקור ולכמת את ההתקדמות של הפצת נגיף למוח המתפתח, כדי להבין ולחזות את סדר הגודל של פציעות הנוירוביולוגי בעתיד. באופן מסורתי, כימות של ההתקדמות של זיהום דורשת הקרבה הקבועה של בעלי חיים נגועים לכיילה את הפתוגן ברקמות, כגון מוח, שהם נגישים אחרים. זה סוג של פרוטוקול כעת לערער על ידי שיפור הכרחי של רווחת בעלי חיים ואת 3Rs (צמצום, מקד, החלף) 14 עקרונות. שימוש בטכנולוגיות ההדמיה vivo עשויה לאפשר הפחתה דרסטית של מספר בעלי החיים אשר נחוצות בזיהום בניסויי vivo. כאן אנו מדווחים ומתארים את ניתוח בזמן קורס של הפצה נגיפית אל תוך המוח על זריקת intraperitoneal MCMV לוק לילודי עכבר. שימוש באותם בעלי החיים, אנחנו במעקב והפיקוח in vivo האתרים של vi האינטנסיבישכפול RAL בתקופה 2 בשבוע.
Protocol
Representative Results
Discussion
שימוש בטכנולוגיית ההדמיה vivo כדי לפקח על הפצת MCMV לוק בילודים עכברים, היינו מסוגלים להתבונן התפשטות נגיף למוח של בעלי חיים שעברו מוטציה, בניגוד לטבע מהסוג. נתיחה נוספת של בעלי החיים וההדמיה vivo לשעבר של המוח אישר את נוכחותו של וירוס זורח במערכת העצבים המר?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לי Tuddenham (IBMC, שטרסבורג) להגברה וtitrating MCMV לוק ותומס Baumert (INSERM U748, שטרסבורג) לאישור להשתמש במתקן בעלי החיים של המכון לווירולוגיה. תמיכה כספית מINSERM, אוניברסיטת דה שטרסבורג וסוכנות הידיעות Nationale de la Recherche (ANR-08-הבעה-005-01) היא הודתה. ההשתתפות הראשונית של סוניה Beroud והלטישה Lelieur במהלך פרויקט הורים שלהם היא גם הודתה.
Materials
| Reagent/Material | |||
| DMEM | Fisher Scientific | W3523A | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | 319112 | |
| Insulin needles | VWR | 613-4897 | |
| Ketamine | CentraVet | Ket 201 | |
| Xylazine/Vetranal | Sigma Aldrich | 46995 | |
| DPBS | DUTSCHER | P0436500 | |
| Luciferin | Caliper | 760504 | |
| gentamycin | Sigma Aldrich | G1272 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15070 | |
| carboxymethylcellulose | Sigma Aldrich | C4888 | |
| formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| crystal violet | Sigma Aldrich | C3886 | |
| Equipment | |||
| IVIS 50 | Caliper/Perkin Elmer |
Referencias
- Loewendorf, A., Benedict, C. A. Modulation of host innate and adaptive immune defenses by cytomegalovirus: timing is everything. J. Intern. Med. 267, 483-501 (2010).
- Lischka, P., Zimmermann, H. Antiviral strategies to combat cytomegalovirus infections in transplant recipients. Curr. Opin. Pharmacol. 8, 541-548 (2008).
- Johnsen, J. I., Baryawno, N., Soderberg-Naucler, C. Is human cytomegalovirus a target in cancer therapy?. Oncotarget. 2, 1329-1338 (2011).
- Morein, B., Abusugra, I., Blomqvist, G. Immunity in neonates. Vet. Immunol. Immunopathol. 87, 207-213 (2002).
- Zaghouani, H., Hoeman, C. M., Adkins, B. Neonatal immunity: faulty T-helpers and the shortcomings of dendritic cells. Trends Immunol. 30, 585-591 (2009).
- Morein, B., Blomqvist, G., Hu, K. Immune responsiveness in the neonatal period. J. Comp. Pathol. 137, 27-31 (2007).
- Cheeran, M. C., Lokensgard, J. R., Schleiss, M. R. Neuropathogenesis of congenital cytomegalovirus infection: disease mechanisms and prospects for intervention. Clin. Microbiol. Rev. 22, 99-126 (2009).
- Tsutsui, Y. Effects of cytomegalovirus infection on embryogenesis and brain development. Congenit. Anom. (Kyoto). 49, 47-55 (2009).
- Sancho-Shimizu, V., et al. Genetic susceptibility to herpes simplex virus 1 encephalitis in mice and humans. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 7, 495-505 (2007).
- Crozat, K., et al. Analysis of the MCMV resistome by ENU mutagenesis. Mamm. Genome. 17, 398-406 (2006).
- Juanjuan, C., et al. Murine model for congenital CMV infection and hearing impairment. Virol. J. 8, 70 (2011).
- Koontz, T., et al. Altered development of the brain after focal herpesvirus infection of the central nervous system. J. Exp. Med. 205, 423-435 (2008).
- Bantug, G. R., et al. CD8+ T lymphocytes control murine cytomegalovirus replication in the central nervous system of newborn animals. J. Immunol. 181, 2111-2123 (2008).
- Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1245, 14-16 (2011).
- Sacher, T., et al. The role of cell types in cytomegalovirus infection in vivo. Eur. J. Cell Biol. 91, 70-77 (2012).
- Lutarewych, M. A., et al. Propagation and titration of murine cytomegalovirus in a continuous bone marrow-derived stromal cell line (M2-10B4). J. Virol. Methods. 68, 193-198 (1997).
