Summary

Um método simples e eficiente para detectar ativação do fator nuclear em neutrófilos humanos por citometria de fluxo

Published: April 09, 2013
doi:

Summary

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue. Os neutrófilos possuem funções transcricionalmente regulados tais como a produção de citocinas pró-inflamatórias e inibição da apoptose. Estas funções podem ser estudadas com o método aqui apresentado, o que permite a detecção e quantificação dos factores nucleares por citometria de fluxo em núcleos isolados

Abstract

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue periférico. Estas células são os primeiros a aparecer nos locais de inflamação e à infecção, tornando-se a primeira linha de defesa contra microorganismos invasores. Os neutrófilos possuem importantes funções antimicrobianas, tais como fagocitose, a libertação de enzimas líticas e produção de espécies reactivas de oxigénio. Em adição às funções de defesa importantes, os neutrófilos realizar outras tarefas, em resposta à infecção, tais como a produção de citocinas pró-inflamatórias e inibição da apoptose. Citocinas recrutar outros leucócitos que ajudam a eliminar a infecção, e a inibição da apoptose permite que o neutrófilo de viver mais tempo no local da infecção. Estas funções são reguladas ao nível da transcrição. No entanto, porque os neutrófilos são células de vida curta, o estudo das respostas transcricionalmente regulados nestas células não pode ser realizada com métodos convencionais de gene repórter já que não há eficientes para técnicas de transfecção de neutrófilos. Aqui, apresentamos um método simples e eficiente, que permite a detecção e quantificação de fatores nucleares em núcleos isolados e immunolabeled por citometria de fluxo. Descrevemos técnicas para isolar puros a partir de neutrófilos de sangue periférico humano, estimular estas células com anti-anticorpos do receptor, isolar e núcleos immunolabel, e analisar os núcleos por citometria de fluxo. O método tem sido utilizado com sucesso para detectar a NF-kB e Elk-1 factores nucleares de núcleos a partir de neutrófilos e de outros tipos de células. Assim, este método representa uma opção para a análise de activação de factores de transcrição no núcleo isolado a partir de uma variedade de tipos de células.

Introduction

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue periférico 1. Durante neutrófilos inflamação e infecção são as primeiras células a aparecer no local afetado, onde eles agem como a primeira linha de defesa 2. Neutrófilos possuem vários mecanismos, incluindo antimicrobianos 3 fagocitose, produção de espécies reativas de oxigênio, liberação de enzimas líticas pela degranulação e produção de citocinas pró-inflamatórias 4,5. Os neutrófilos são células de curta duração que são rapidamente ativadas através de sinalização de receptores de superfície vários celulares. Embora os neutrófilos foram consideradas células de terminal, devido à sua curta vida e porque eles sofrem apoptose, a menos que activada durante o processo inflamatório 6, é agora evidente que pode também modificar o seu fenótipo, alterando o nível de transcrição de genes específicos. A produção de citocinas 5 e a inibição da apoptose 7,8 são dois important funções de activação dependentes de células reguladas ao nível da transcrição dos neutrófilos. Factor nuclear kB (NF-kB) participa no controlo transcricional da produção de citoquina e 4 na regulação da sobrevivência celular e apoptose 9-11 em vários tipos de células.

As vias de sinalização que levam à ativação do fator nuclear são estudados por ensaios de gene repórter ou por ensaios de mobilidade eletroforética turno (EMSA). No entanto, porque os neutrófilos são células de vida curta, o estudo das respostas transcricionalmente regulados nestas células não pode ser realizada com os ensaios de gene repórter, uma vez que não existem técnicas eficazes para a transfecção de neutrófilos. Ensaios de EMSA foram usados ​​em neutrófilos para explorar activação do factor nuclear 12,13, no entanto, esta metodologia é complicada e dispendiosa uma vez que envolve a utilização de material radioactivo. Nucleofection é uma outra técnica que tem sido utilizada successfully para transfectar monócitos 14. Assim, pelo menos em teoria, a activação do factor nuclear pode ser detectado nos neutrófilos por transfecção (apesar de baixa eficiência). No entanto, esta técnica poderia ser mais dispendioso, demorado e provavelmente menos quantitativo. A análise microscópica de células imunomarcadas também poderia ser usado para detectar factores nucleares no núcleo. Com efeito, temos detectado translocação de NF-kB para o núcleo deste modo 15. Infelizmente, esta técnica também é demorada, menos quantitativos, e sujeita a viés do observador.

Aqui, apresentamos um método simples e eficiente, que permite a detecção e quantificação de fatores nucleares em núcleos isolados e immunolabeled por citometria de fluxo. Descrevemos técnicas para isolar os neutrófilos a partir de sangue periférico humano, estimular estas células via integrinas ou receptores de Fc com anti-anticorpos do receptor, isolar e núcleos immunolabel, e analisar os núcleos por citometria de fluxo (Figura 1). O método tem sido utilizado com sucesso para detectar a NF-kB 15 e Elk-1 16 factores nucleares de núcleos de neutrófilos. A sensibilidade deste método permite a detecção de pequenas mudanças nos níveis do factor nuclear no núcleo. Este método também pode ser utilizado para analisar o nível de factores de transcrição no núcleo de outros tipos de células.

Protocol

1. Isolamento de Neutrófilos (PMN) a partir de Sangue Humano Usar cerca de 20 ml de sangue humano com heparina (10 U / ml) como anti-coagulante. O sangue foi coletado de voluntários adultos saudáveis ​​por venopuntura. Todos os experimentos foram realizados com a aprovação da Comissão de Bioética no Instituto de Investigaciones Biomédicas – UNAM. Coloque 2 ml de 6% de dextrana T500 em PBS num tubo de centrífuga de 15 ml e adicionar 10 ml de sangue. Misturar invertendo o tubo de duas ou …

Representative Results

O método de purificação descrito aqui fornece geralmente neutrófilos não estimulados (PMN) com pureza superior a 95% (Figura 1A). PMN isolado pode então ser estimulada pelos receptores de reticulação específicos com anticorpos monoclonais específicos. Temos estimulado PMN através de receptores Fc e integrinas (Figura 1B). Uma vez estimulado, PMN são lisadas e os núcleos são isolados com rendimentos elevados. Os núcleos são então immunolabeled para um determinado factor …

Discussion

O método de purificação descrito aqui permite o isolamento dos neutrófilos não estimulados (PMN) com pureza superior a 95% (avaliada por observação microscópica), num curto período de tempo. Por vezes, os neutrófilos podem ser contaminados por eritrócitos, se este não estiver completamente lisadas. Isso geralmente não afetam a técnica, uma vez que os eritrócitos e PMN pode facilmente ser distinguido como populações de células distintas por citometria de fluxo. PMN isolado pode então ser estimulada pel…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer a Nancy Mora por sua assistência técnica.

Este trabalho foi financiado por bolsas de investigação 48573-M e 168098 do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, do México, e por doações e IN212308 IN205311-2 da Dirección General de Asuntos del Academico Pessoal, Universidad Nacional Autónoma de México, México.

Materials

REAGENTS
Heparin PiSA (Mexico)
Dextran T500 Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) T1-Dextran T500
Ficoll-Paque Pharmacia 17-0320-01
Sodium chloride Sigma S7653
Sodium phosphate monobasic Sigma S9638
Sodium phosphate dibasic Sigma S9390
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A2153 Cohn Fraction V
HEPES Sigma H3375
Potassium chloride Sigma P9541
Magnesium chloride anhydrous Sigma M8266
DL-dithiothreitol (DTT) Sigma D9163
Trypan Blue (0.4 % solution) Sigma T8154
Paraformaldehyde Sigma P6148
Triton X-100 Sigma X100
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO 10437-028
Monoclonal antibody IV.3 Medarex (Annandale, NJ) 025-1 Human-specific anti-FcRII (CD32)
Monoclonal antibody 3G8 Medarex (Annandale, NJ) 028-2 Human-specific anti-FcRIII (CD16)
Monoclonal antibody TS2/16 Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) Donated by Dr. Martin Hemler Human-specific anti-β1 integrin (CD29)
Monoclonal antibody IB4 University of California, San Francisco Donated by Dr. Eric J. Brown Human-specific anti-β2 integrin (CD18)
F(ab’)2 goat anti-mouse IgG Cappel (Aurora, OH) 55468
FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-mouse IgG Cappel (Aurora, OH) 55522
FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG Cappel (Aurora, OH) 55665
Anti-NF-κB p50 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) sc-114 Rabbit polyclonal antibody
Anti-NF-κB p65 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) sc-109 Rabbit polyclonal antibody
EQUIPMENT
15-ml centrifuge tube Corning 430791
50-ml centrifuge tube Corning 430291
Centrifuge, Sorvall Tabletop Dupont Instruments RT 6000D
pH-meter Corning 340
Pipetman pipette P-20 Gilson F123600
Pipetman pipette P-200 Gilson F123601
Pipetman pipette P-1000 Gilson F123602
Hemocytometer Fisher Scientific 0267110
Microscope Nikon Eclipse E600
Inverted microscope Nikon TMS
Water Bath Incubator Fisher Scientific 2IS-M
Microcentrifuge Eppendorf 5414C
Microcentrifuge Eppendorf 5418
Flow Cytometer Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) FACScalibur

Referencias

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Citar este artículo
García-García, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410, doi:10.3791/50410 (2013).

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