Aquí presentamos un protocolo optimizado y detallado para la inmunotinción doble en secciones de tejido del sistema nervioso central (SNC) y de los ganglios linfáticos periféricos (LN) de rata fijadas en formol, incluidas en parafina.
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Artículo de método
El análisis inmunohistoquímico en el sistema nervioso central y periférico de la rata de nodo linfático secciones de tejido
En este artículo
Resumen
Resumen
La inmunohistoquímica (IHC) proporciona una visualización altamente específico, fiable y atractivo proteína. rendimiento correcta y la interpretación de un etiquetado multicolor basado en la IHC es un reto, especialmente cuando se utiliza para la evaluación de las interrelaciones entre las proteínas diana en el tejido con un alto contenido de grasa, tales como el sistema nervioso central (SNC).
Nuestro protocolo representa un refinamiento de la técnica immunolabeling estándar especialmente ajustado para la detección de ambas proteínas estructurales y solubles en el CNS de rata y de los ganglios linfáticos periféricos (LN) afectadas por la neuroinflamación. No obstante, con o sin modificaciones adicionales, nuestro protocolo probablemente podría ser utilizado para la detección de proteínas relacionadas con otros objetivos, incluso en otros órganos y especies que aquí se presenta.
Introducción
A pesar de la utilización de tecnologías avanzadas de alto rendimiento de los análisis realizados en el metiloma, transcriptoma o incluso de proteoma, inmunotinción sigue siendo el estándar de oro para la detección de proteínas directamente en la muestra de tejido, cultivo celular o un frotis celular. Al revelar el patrón de localización / distribución, inmunohistoquímica (IHC) puede evaluar proporciones relativas y las interrelaciones topográficas de las proteínas diana, e incluso indicar sus actividades biológicas. Por lo tanto, IHC se utiliza ampliamente para fines clínicos y de investigación, por ejemplo, para el diagnóstico, tratamiento, evaluaciones es....
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Protocolo
Declaración de ética
El presente estudio se realizó de acuerdo con las directrices de la Junta Nacional Sueca de Animales de Laboratorio y la Directiva del Consejo de la Comunidad Europea (86/609 / CEE), por los permisos éticos N338 / 09, N15 / 10 y N65 / 10, los cuales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal Estocolmo Norte.
1. Preparación del tejido
- Perfusión y de fijación
- Anestesiar al animal con isoflurano para realizar la perfusión transcardial a través del ventrículo izquierdo. Iniciar el enjuague de la vasculatura con solución salina tamponada con fosfato (PBS) par....
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Resultados
immunostainings dobles (co-tinciones) se realizaron en fijado en formol e incluido en parafina de rata secciones del SNC y LN. 3-5 micras rodajas de tejido espesor fueron cortadas usando un microtomo trineo, montados posteriormente en portaobjetos de vidrio recubierto con adhesivo previamente y se trata como se ha descrito previamente 10,11,12. En resumen, después deparaffinizing, la rehidratación del tejido y la inactivación de la peroxidasa endógena, las secciones se sometie.......
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Discusión
Los procedimientos estándar de IHC menudo requieren ajustes específicos para obtener un resultado óptimo, lo que comúnmente implica una amplia experiencia, sino también de "ensayo y error" enfoque. Desde la preparación hasta la visualización del tejido diana, casi cada paso en el protocolo puede ser sometida a modificaciones diseñadas de forma individual con el fin de mejorar el resultado final. protocolo de tinción doble que aquí se presenta un ejemplo de proteínas a base de IHC focalización particular ajusta.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a Hans Lassmann y Jan Bauer por su orientación y apoyo. También agradecemos a Katalin Benedek por su excelente asistencia técnica y a Caroline Westerlund por su evaluación crítica y lingüística.
Este estudio fue financiado por subvenciones de Biogen Idec, la Fundación Wenner-Gren, el Consejo Sueco de Investigación, la Asociación Sueca de Personas con Discapacidades Neurológicas, la Fundación Sueca del Cerebro, el 6º Marco de la UE EURATools (LSHG-CT-2005-019015) y Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publica....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| fuerte | |||
| Isoflurano (Isofluran): 1-Cloro-2,2,2-trifluoretilo (éter difluormetílico) 2-Cloro-2-(difluormetoxi)-1,1,1-trifluoretano (C3H2ClF5O) | Baxter | 1001936060 | Irradiación ocular. Probablemente influye en la fertilidad y daña al bebé en el útero. Administrar solo en un ambiente anestésico adecuadamente equipado. |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Merck | 1.0604 | |
| Tampón de fosfato salino (PBS), tableta | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Paraformaldehído (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% en 1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | salud. Corrosivo. Inflamable. Toxicidad aguda. |
| Etanol ≥ 99.5%, absoluto (CH3CH2OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | Inflamable. |
| Xileno (Xilenos, grado histológico; C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 Inflamable. Toxicidad aguda. | |
| Histo-Comp Cera de parafina | Tissue-Tek | V0-5-1001 | |
| Portaobjetos de microscopio adhesivo | Starfrost | MIC-1040-W | |
| Sustituto de xilol XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | Sensibilización respiratoria. Carcinogenicidad. |
| α-CD8 (Ox-8) ratón anti-rata, anticuerpo primario | AbD Serotec | MCA48G | |
| α-Iba1 (AIF1) ratón anti-rata, anticuerpo primario | Millipore | MABN92 | |
| α-CD68 (ED1) ratón anti-rata, anticuerpo primario | AbD Serotec | MCA341R | |
| α-eotaxina C-19 (CCL11) cabra anti-rata, anticuerpo primario | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| Anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina (AP) | Dakopatts, Dinamarca | D0314 | |
| Anticuerpo secundario biotinilado | Amersham Biotech | RPN1025 | |
| Avidina-complejo peroxidasa de rábano picante (HRP) | Sigma-Aldrich | A3151 | |
| Naftol AS-MX fosfato (C19H18NO5P) | Sigma-Aldrich | N4875-1G | Toxicidad aguda. |
| Sal RR Azul Rápida, Diazo Azoico Nº 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Clorhidrato de levamisol (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | Toxicidad aguda. |
| 3,3'-Diaminobencidina tetraclorhidrato (Cromo DAB) | DAKO | S3000 | Altamente inflamable. Nocivo. |
| Sulfato de cobre (CuSO4) | Merck | 1.02791 | Toxicidad aguda. Peligrosidad ambiental. |
| GelTol Medio de montaje acuoso | Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| Peróxido de hidrógeno, 30% (H2O2) | Merck | 107210 | Toxicidad aguda. |
| Metanol (CH3OH) | Fluka | 65543 | Toxicidad aguda. Sensibilización respiratoria. Carcinogenicidad. Inflamable. |
| Tris (hidroximetil) aminometano, TRIS base (C4H11NO3 ) | AppliChem | A1379 | Irritación de la piel y los ojos. |
| Solución salina tamponada Tris (TBS), tableta | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| Di- Hidrogenofosfato de sodio dihidratado (Na2HPO4 x 2H2O) | Merck | 1.0658 | |
| Dihidrógeno fosfato de sodio monohidratado (NaH2PO4 x 1H2O) | Merck | 1.06346 | |
| Suero fetal de ternera (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| Tampón de lavado por citomación DAKO 10x | DAKO | S3006 | Debe almacenarse a 2-8 & deg; C para inhibir el crecimiento bacteriano. Evite la formación de espuma. |
| N,N-Dimetilformamida; DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | Inflamable. Toxicidad aguda. |
| Cubreobjetos de vidrio 24 x 36 mm | Menzel-Glä ser | BB024036A1 | |
| Ácido clorhídrico, conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | Corrosivo, irritante, permeante. Sensibilizador pulmonar (en forma de neblina ácida). Nocivo. |
| Solución volumétrica de ácido clorhídrico, 2 M HCl (2 N) | Fluka | 71826 | Corrosivo, irritante, permeante. Sensibilizador pulmonar (en forma de neblina ácida). Nocivo. |
| Nitrito de sodio, ReagentPlus, ≥ 99.0% (NaNO2) | Sigma-Aldrich | S2252 | Oxidante. Nocivo. Peligroso para el medio ambiente. |
| Sal disódica dihidratada de ácido etileninittrilotetraacético (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | Las exposiciones orales pueden causar efectos reproductivos y de desarrollo. |
| Equipo | |||
| Tissue-TekV.I.P Procesador de infiltración al vacío | Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz | |
| Hacker-Bright 8000 Series Microtomo de trineo | base Instrumentos Hacker Vaporizador | ||
| alimentos para el hogar | Braun | MultiGourmet FS 20 | |
| Microscopio óptico | Leica Polyvar 2 |
Referencias
- Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B.
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Reimpresiones y permisos
