Утилита Стадия конкретных Середина-конце<em> Дрозофилы</em> Фолликул Изоляция
Summary
Стадия конкретных изоляция середине-конце Drosophila фолликулов полезна для различных целей. Такие фолликулы развиваются в культуре, что позволяет генетических и / или фармакологических манипуляций, чтобы использоваться в сочетании с в пробирке анализов развития и живого изображения. Кроме того, фолликулы могут быть использованы для молекулярных исследований, таких как изолирующий мРНК и белок.
Abstract
Drosophila оогенез или развитие фолликула широко используется для продвижения понимания сложных развития и клеточных биологических процессов. Это методы статья описывает, как изолировать середине-конце этапа фолликулы (Стадия 10В-14) и использовать их, чтобы обеспечить новому взглянуть на молекулярном и морфологических событий, происходящих во время жесткой окон времени развития. Изолированные фолликулы могут быть использованы для различных экспериментальных методов, в том числе в пробирке анализов развития, живого изображения, анализа экспрессии мРНК и Вестерн-блоттинга белков. Фолликулы на стадии 10B (S10B) или более поздней версии завершит разработку в области культуры; это позволяет объединить генетические или фармакологические возмущения с развитием в пробирке, чтобы определить последствия таких манипуляций на процессы, происходящие в определенные периоды развития. Кроме того, поскольку эти фолликулы развиваются в культуре, они идеально подходят для изучения живого изображения, Которые часто показывают новые механизмы, которые опосредуют морфологические события. Изолированные фолликулы также могут быть использованы для молекулярных анализов. Например, изменения в экспрессии генов, которые являются результатом генетических возмущений может быть определен для конкретных окон развития. Кроме того, уровень белка, стабильность, и / или посттрансляционная состояние модификация в течение определенного этапа развития фолликула может быть рассмотрено через вестерн-блот анализа. Таким образом, изоляция стадиеспецифический из Drosophila фолликулов обеспечивает богатый источник информации в широко консервативных процессов развития и морфогенеза.
Introduction
Каждый дрозофилы яичников состоит из ~ 16 овариол или цепочек последовательно созревания яиц камер или фолликулов. Каждый фолликул состоит из одного ооцита, 15 зародышевой линии, полученные медсестра или поддерживающих клеток и ~ 650 соматических клеток, называемых фолликул клеток (фиг. 1A). Drosophila оогенез разделена на 14 морфологически определенных стадиях развития 1. Каждый этап развития фолликула наблюдается много раз в пределах одного лету, что делает его относительно легко изолировать значительное количество сценических конкретных фолликулов.
В середине-конце этапы оогенезе (Этапы 10B-14) особенно хорошо подходят для изоляции стадии (рис. 1). В Этап 10B (S10B), фолликул полностью вытянута (т.е. его длина равна стадии 14 (S14) фолликула, см. рисунок 1 и рисунок 2H) и половины длины фолликула состоит из питающих клетокв то время как другая половина является ооцитов (рис. 1С). На данном этапе медсестра клетки подвергаются драматический актина ремонт, укрепление корковой актин и генерации параллельных пучков нитей актина 2. В то же время, население ячейки стручка, называется центростремительные клетки, мигрируют в между питающих клеток и яйцеклетки, и два спинных группы ячейки стручка стать указанный пройти миграции для формирования спинные придатки, трубчатые дыхательные аппараты для эмбриона 3 . Медсестра клетки затем контракт (S11), сжимая свои цитоплазматические содержимое в яйцеклетку в процессе, называемом медсестра клеток демпинга, который обеспечивает яйцеклетки с виду факторы, необходимые для того, чтобы завершить эмбриогенеза (рис. 1D). Медсестра клетки затем пройти гибель клеток (S12-S13) 4, и фолликул клетки секретируют и рисунок на яичную скорлупу 5 (рис. 1E-G). Таким образом, конец оогенезе богат важной ап развитияг морфогенетические процессы.
Изолированные середине-конце этапа фолликулы (S10B-S14) может быть использован для различных целей, в том числе молекулярных анализов. Например, мРНК из фолликулов, организованных могут быть выделены для ОТ-ПЦР, микрочипов, или РНК-SEQ анализов. Это позволяет смотреть на экспрессии генов в течение короткого окна развития, с помощью всего нескольких типов клеток, присутствующих, и определить, как экспрессия генов изменяется либо фармакологических или генетических возмущений. Стадия изоляция может также использоваться, чтобы смотреть на белках с помощью вестерн-блоттинга. Такой анализ важен, поскольку он позволяет количественно уровень экспрессии белка дикого типа по сравнению с мутантами на определенных этапах. Хотя можно было бы использовать иммунофлуоресцентного анализа для достижения аналогичных результатов, количественное определение флуоресценции менее надежными из-за строгих требований, которые все пиксели быть в пределах линейного диапазона обнаружения 6. Кроме того, вестерн-блот анализ может предоставить другую информацию, напримерс если белок посттрансляционно изменены или выражается с определенной изоформы сплайсинга. Изолированные этапы также могут быть использованы для дальнейшей очистки белка, в том числе внутриклеточного фракционирования или коиммунопреципитации подтверждено.
Стадия конкретных изоляции фолликул также может быть использован для в пробирке анализов развития 7 и живого изображения 8. Изолированные S10B-S13 фолликулы будут и впредь развиваться на S14 в простой питательных сред (см. ниже). Важно отметить, что S10A фолликулы не будет прогрессировать через медсестры клетки сброс с использованием условий культивирования, обсуждаемые в этой рукописи. Мы использовали S10B в пробирке анализов развития определить роль простагландинов, как фармакологически и генетически, в регулировании актина ремоделирования с помощью медсестры ячейку демпинг и развитие как прочитанные-аутов 7,9. Точно так же более поздних стадиях развития могут быть также выделены для определения последствий фармакологического лечения или генетической человекаipulations по конкретным процессов, таких как центростремительной миграции клеток, спинной придатком миграции / формирования 10, и смерти медсестры клеток. Такие анализы могут быть использованы для выполнения доминирующие экраны взаимодействия или анализов, например, в то время как гетерозиготность мутаций в PXT или fascin только не имеют никакого влияния на S10B развития в пробирке, фолликулы от двойных гетерозигот экспонат медсестра клеток демпинговым дефекты и блок в развития 9.
Кроме того, поскольку S10B-13 может развиваться в культуре, все процессы, которые происходят в это время можно наблюдать живой-изображений. Такая процедура может быть проведена просто с помощью проходящего света (если интересоваться только в грубых изменений в морфологии) или с конфокальной микроскопии с использованием трансгенных мух, выражающие флуоресцентных зондов или фолликулов, окрашенные в прямом эфире изображений красителей. Онлайн изображений используется существенно продвинуть наше понимание процессов развития. Действительно, жить Imaginг поздней стадии фолликулов расширила знания спинной придаток миграции, пример тубулогенеза 10. Мы ожидаем, что жить изображений дополнительных поздней стадии процессов, в том числе динамики актина во время медсестра клетки демпинговым, обеспечит новые идеи этих событий в развитии. Важно отметить, что в то время как S10A и ранние этапы развития фолликула не будет продолжать развиваться в S14 в культуре, жить-визуализации событий, происходящих в течение этих стадиях развития возможно с помощью альтернативных условиях культивирования 11-14 (см. Обсуждение для более информация).
Здесь мы предлагаем подробные протоколы для изоляции поздней стадии фолликулы либо развития в пробирке и жить-визуализации или молекулярного анализа (мРНК и изоляции белка).
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila фолликул состоит только из небольшого числа типов клеток, что делает его идеально подходит как для морфологических и молекулярных анализов. Кроме того, из-за структуры яичника, это относительно легко получить большое количество конкретных стадиях развития фолликулов с общ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Томаса Lecuit (SQH-атрофина :: GFP линия), в Блумингтон со-центр, и процесс развития Studies гибридомные банк для реагентов. Кроме того, мы благодарим всех членов Tootle Lab за полезные обсуждения и критики рукописи. Финансирование от Национального научного фонда MCB-1158527, и исходные финансовые средства от анатомии и Департамента клеточной биологии, Университет Айовы поддержала эту работу. Национальные институты здравоохранения Predoctoral подготовки Грант в фармакологических наук T32GM067795 поддерживается AJS. Поддержка хранения данных была предоставлена ИКТ, который финансируется через CTSA при поддержке Национального Центра Ресурсов Исследования и Национального центра Продвижение поступательного науки, Национальные Институты Здоровья, через Грант UL1RR024979.
Materials
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | Any source of Active Dry Yeast is fine |
| Grace’s Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | Any Heat Inactivated FBS should work |
| 10x Pen/Strep | Gibco/Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises and Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 multi-well plates | Becton Dickinson | 35 3226 | Any 24-well tissue culture dish should work |
| Coverslip Bottom Dishes (35mm) | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used |
| Glass pipettes | Corning | 7095B-5x (for transferring follicles) | |
| Glass pipettes – long | Corning | 7095B-9 (for producing pulled pipettes) | |
| Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) | Research Products International | 199228 | Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
Referencias
- Spradling, A. C., Bate, M., Martinez-Arias, A. . The development of Drosophila melanogaster. , 1-70 (1993).
- Guild, G. M., Connelly, P. S., Shaw, M. K., Tilney, L. G. Actin filament cables in Drosophila nurse cells are composed of modules that slide passively past one another during dumping. J. Cell Biol. 138, 783-797 (1997).
- Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: epithelial morphogenesis in the Drosophila egg chamber. Dev. Dyn. 232, 559-574 (2005).
- McCall, K. Eggs over easy: cell death in the Drosophila ovary. Dev. Biol. 274, 3-14 (2004).
- Berg, C. A. The Drosophila shell game: patterning genes and morphological change. Trends Genet. 21, 346-355 (2005).
- Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry–issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2006).
- Tootle, T. L., Spradling, A. C. Drosophila Pxt: a cyclooxygenase-like facilitator of follicle maturation. Development. 135, 839-847 (2008).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
- Groen, C. M., Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Tootle, T. L. Drosophila Fascin is a novel downstream target of prostaglandin signaling during actin remodeling. Mol. Biol. Cell. 23, 4567-4578 (2012).
- Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 267, 320-341 (2004).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Dev. Cell. 12, 997-1005 (2007).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, 2207-2215 (2011).
- Bianco, A., et al. Two distinct modes of guidance signalling during collective migration of border cells. Nature. 448, 362-365 (2007).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Kelso, R. J., et al. Flytrap, a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 32, 418-420 (2004).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genética. 175, 1505-1531 (2007).
- Tootle, T. L., Williams, D., Hubb, A., Frederick, R., Spradling, A. Drosophila eggshell production: identification of new genes and coordination by Pxt. PLoS. One. 6, e19943 (2011).
- Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
