考试<em>果蝇</em幼虫气管终端细胞光镜
Summary
在这里，我们提出了一个方法气管终端细胞在光镜下分析<em>果蝇</em>幼虫。这种方法允许分支和管腔形态在整个动物的快速检查和分析个别突变体或突变影响终端细胞发育的屏幕将是有益的。
Abstract
细胞的形状是细胞功能的关键。然而，尽管细胞形态的重要性，很少有人了解单个细胞如何产生特定的形状。 果蝇气管码头细胞已经成为一个强大的遗传模型生成细胞形态识别和阐明基因的角色。终端细胞是支链的管状网络的一个组成部分，气管系统，内部组织提供氧气的功能。终端细胞是细胞形态的调查问题，因为他们拥有两个不同的蜂窝结构的一个很好的模型。首先，终端细胞有一个复杂的支链的形态，类似的复杂的神经元;第二端细胞分支形成为细管，并包含一种膜结合的细胞内管腔。定量分析终端小区内支路数，枝条组织和个人分支形状，可以用来提供特定的基因机甲的角色信息anisms在决策支电池。在这些细胞中的小管形成的分析可以揭示保守机制的体外小管到其他管状网络，如脊椎动物的血管。这里，我们描述的技术，可以用来迅速修复，图像，并分析两个分支模式和管在终端细胞内形成果蝇幼虫。这些技术可以用于分析终端细胞中野生型和突变型的动物或遗传马赛克。因为此协议的高效率，它也适用于遗传，RNAi为基础，或药物屏幕在果蝇气管系统。
Introduction
细胞的形状为单个细胞内的生物体中的功能是至关重要的，以及细胞，组织或器官的一部分功能。我们使用果蝇气管终末细胞，昆虫呼吸系统的一个组成部分，调查的分子机制，参与在控制两个保守类型的细胞形态：分支和管形成（lumenogenesis）。网络支管的前端位于终端细胞的功能来输送氧气的内部组织1，有一个复杂的支链的形态，取决于所控制的局部氧水平于靶组织2 FGF信号通路。端细胞分支细管，与一个充满气体的贯穿每个分支的亚细胞管腔。不同的蜂窝结构的终端单元，以及由在果蝇中，可以进行遗传分析的简易性，使这些细胞的优异的F型或调查机制的细胞生长，分支，和细胞内管形成。终末细胞的信号转导通路，导致支细胞分化的生长，成熟2-4了解一些已经证明一个有用的模型。使用该系统的公正，正向遗传筛选的细胞形态突变已被执行，控制细胞的形状5,6机制产生的见解。例如，这些屏幕显示，特定RabGAP的所需的细胞骨架的极性和管腔形成囊泡运输和定位7，整合素介导的粘附所需的分支稳定性8，该上皮细胞的PAR极性蛋白调节所需的偏振膜运输分支和管腔形成9。终末细胞的其他研究表明，非对称的肌动蛋白的积累和微管组织需要细胞伸长和lumenogenesis的<s高达> 10。因此，多样化的，保守的细胞生物学机制有助于终端细胞形态。
这里，我们描述的方法迅速修复分析端细胞分支和管腔形成完好的第三龄果蝇幼虫。此协议也可以进行第一和第二龄期的动物。这种技术的关键是客户终端可视化细胞的基因标记的荧光蛋白表达直接通过完整的动物的幼虫角质层。由于此过程不需要任何固定后的处理，如抗体染色，观察细胞，它是非常适合高通量分析，包括基因或药物筛选。荧光蛋白的表达揭示了细胞质充满分支的结构。管形成，可以并行使用明视场显微术，以确定充有气体的腔，它与周围的流体填充对比监测ED组织。
包括在此协议中的方法，用于产生根据MARCM系统11，以产生纯合突变终端另有未标记动物与荧光蛋白标记细胞的遗传马赛克。这是必要的，因为只有终端细胞阐述其复杂的结构发展相对较晚，要求在其他组织早在发展基因遗传马赛克允许旁路。要产生MARCM克隆，气管被标记为使用这里描述的气管专用驱动气喘吁吁（BTL）12。果蝇 X染色体的协议;其他染色体的相似的方法可以被使用，适当的染色体与遗传试剂审查。在此，气管的细胞质本地化GFP标记的表达，但该过程同样适用与其他荧光蛋白，红色荧光蛋白等的表达。
此外，我们还包括量化分支模式和管腔形成终末细胞的基础上发展为特征的神经元分支图案13的方法，一种方法。这种量化的数据可以识别基因的确切作用在的分支或lumenogenesis过程中，以及允许不同的突变体9之间的直接比较中是至关重要的。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述的热固定技术是一种快速，方便的工具，成像果蝇幼虫气管终末细胞。在这里，我们使用这种技术来研究野生型细胞分支和流明模式。气管细胞表达GFP，气管特异性启动子气喘吁吁驱动，可以很容易地可视化，通过热固定后的幼虫角质层。的具体的分支型态的单独终端细胞，以及那些充满空气的腔，可快速可视化，并使用这个方法测量。这种技术也可以进行第一和第二龄幼?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢阿娇斯坦菲尔德对稿件的意见。 TAJ支持犹他州遗传学培训格兰特T32 GM007464从NIH NIGMS大学中。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
Referencias
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