Modifica multi-scala di impianti metallici con gradienti poro, polielettroliti e il loro monitoraggio indiretto<em> In vivo</em
Summary
In questo video, dimostreremo tecniche di modificazione per porosi impianti metallici per migliorare la loro funzionalità e per controllare la migrazione delle cellule. Le tecniche includono lo sviluppo di gradienti pori per controllare il movimento delle cellule in 3D e produzione di membrana basale imita per controllare il movimento delle cellule in 2-D. Inoltre un metodo HPLC-based per il monitoraggio integrazione dell'impianto in vivo mediante analisi delle proteine del sangue è descritto.
Abstract
Impianti metallici, in particolare impianti di titanio, sono ampiamente utilizzati in applicazioni cliniche. Tessuto in crescita e l'integrazione di questi impianti nei tessuti sono parametri importanti per i risultati clinici di successo. Al fine di migliorare l'integrazione del tessuto, sono state sviluppate impianti metallici porosi. Porosità aperta di schiume metalliche è molto vantaggiosa, in quanto le aree del poro possono essere funzionalizzata senza compromettere le proprietà meccaniche di tutta la struttura. Qui si descrivono le modifiche che utilizzano impianti in titanio poroso a base di microsfere in titanio. Utilizzando le proprietà fisiche intrinseche quali idrofobicità di titanio, è possibile avere gradienti pori idrofobi entro microperla impianti metallici based e allo stesso tempo di avere una membrana basale mimo basa su idrofili, polimeri naturali. Gradienti poro 3D sono formate da polimeri sintetici come acido poli-L-lattico (PLLA) mediante metodo freeze-estrazione. 2D nanofibrillar surfacce sono formati utilizzando collagene / alginato seguita da una fase di reticolazione con un reticolante naturale (genipin). Questo film nanofibrillar è stato costruito da strati con il metodo di deposizione delle due molecole di carica opposta, collagene e alginato strato (LBL). Infine, un impianto dove diverse aree possono ospitare diversi tipi di cellule, in quanto ciò sia necessario per molti tessuti multicellulari, può essere ottenuto. Da, in questo modo il movimento cellulare in direzioni diverse da diversi tipi di cellule può essere controllato. Tale sistema è descritto per il caso specifico di trachea rigenerazione, ma può essere modificata per altri organi bersaglio. Analisi della migrazione cellulare e le possibili metodi per la creazione di diversi gradienti pori vengono elaborati. Il passo successivo nella analisi di tali impianti è la loro caratterizzazione dopo l'impianto. Tuttavia, l'analisi istologica di impianti metallici è un processo lungo e ingombrante, quindi per il monitoraggio reazione host per impianti metallici in vivo di unlternative metodo basato sul monitoraggio proteine del sangue CGA e diverso è anche descritto. Questi metodi possono essere utilizzati per lo sviluppo in vitro la migrazione su misura e test di colonizzazione e di essere utilizzato anche per l'analisi di funzionalizzati impianti metallici in vivo senza istologia.
Introduction
Attualmente sono disponibili impianti metallici sono adatti per applicazioni portanti, ma la loro non degradabilità richiede disegni che garantiscono una forte interfaccia con il tessuto circostante li 1. Prevedendo strutture che facilitano la crescita cellulare in-e la colonizzazione in vivo, la vita di impianti metallici può essere prolungato 2. Apertamente porosi impianti metallici sono materiali per l'ingegneria dei tessuti interfaccia promettenti e anche per garantire una buona colonizzazione degli impianti. Essi sono stati utilizzati attivamente, come impianti ortopedici e anche come protesi tracheali 3-5. Tuttavia, vi sono ancora problemi che devono essere risolti come il controllo preciso movimento delle cellule nelle zone dei pori. Incapacità di controllare questo processo potrebbe portare alla colonizzazione incompleta in una estremità e restenosi nell'altra. Inoltre un'ulteriore funzionalizzazione di questi impianti è necessario per raggiungere funzioni superiori come, consegna di fattori di crescita,vascolarizzazione diretto e movimento simultaneo di diversi tipi di cellule 6-8. Per impianti tracheali, questo è cruciale come la colonizzazione dell'impianto da un tessuto vascolarizzato è auspicabile. Tuttavia, il tessuto incontrollata crescita interna al lume della trachea è indesiderabile perché diminuisce implantare pervietà.
Una possibilità di controllare il movimento delle cellule è la dimensione di esclusione. Conoscendo la dimensione delle cellule bersaglio e la loro capacità di interagire con un dato polimero sintetico è possibile sviluppare gradienti di pori che possono determinare efficacemente la profondità di movimento cellulare. Ad esempio creando un'architettura poro che è abbastanza grande per l'ingresso di cellule del tessuto connettivo, quali fibroblasti extraluminally, ma abbastanza piccoli (meno di 10 micron) per impedire il loro movimento intraluminale un efficace controllo colonizzazione di una protesi tubolare può essere raggiunto.
Dal metodi di creazione dei pori disponibili come freeze-essiccazione ding, la lisciviazione di particelle, gas schiumogeno 9,10, il più facile da adattare il metodo per la rapida formazione di gradienti pori con quantità minima di attrezzature necessarie è freeze-estrazione 11. In questo metodo, una soluzione polimerica è congelato in una miscela binaria di un solvente organico ed acqua. Successivamente, il solvente viene scambiato tramite estrazione con un liquido miscibile pre-raffreddata come etanolo. Congelamento e condizioni di estrazione determinano la forma e la dimensione dei pori e se l'estrazione avviene in un modo in cui può essere controllato il movimento della soluzione di estrazione, forma e dimensione dei pori può essere modulata direzionalmente.
Secondo passo per tessuti multicellulari è la formazione di barriere porose tra diversi tipi cellulari per controllare il loro interazione. Ciò è necessario anche per la disponibilità di diversi microambienti per diversi tipi di cellule a seconda delle loro esigenze 12,13. Trachea è un organo tubolare che collega laringe con BRONCHi. Ha un rivestimento interno pseudostratificato epitelio ciliare con interdispersed cellule caliciformi che producono muco. La struttura 3D della trachea e la stabilità è mantenuta da cartilagine a forma di C-ring. Così, in una trachea artificiale ci dovrebbe essere una giunzione definita tra il tessuto connettivo e lo strato epiteliale ciliare. Mentre una struttura 3D è necessario del tessuto connettivo, la migrazione delle cellule epiteliali richiede una membrana-come seminterrato superficie per ottenere movimento direzionale e la chiusura della ferita. Polielettrolita film multistrato (PEM) sono una possibile opzione per ottenere seminterrato imita membrana. Metodo layer-by-layer (LBL) è un processo versatile per ottenere rivestimenti superficiali sottili e funzionale. Essa si basa su interazioni elettrostatiche di due polielettroliti di carica opposta e il loro accumulo nei maniera sequenziale per ottenere rivestimenti di superficie su scala nanometrica le cui proprietà può essere variato cambiando semplicemente variabili come specie polielettrolita, pH,numero strati, aggiunta di uno strato di tappatura, reticolazione ecc Uno dei principali vantaggi del metodo LBL è la sua capacità di conformarsi alla topografia del substrato sottostante. Così, in condizioni controllate questo metodo può essere utilizzato anche per ottenere la copertura superficiale di strutture porose. Se collagene viene utilizzato come uno dei polielettroliti è possibile ottenere strutture nanofibrillar che possono mimare la superficie della membrana basale. L'idrofobicità del titanio consente lo sviluppo di tali strutture e fibrillarity può essere conservato in strati spessi 14. Questo modo attaccamento e movimento di cellula sulla superficie può anche essere controllato. Utilizzando freeze-estrazione e pellicole di rivestimento Lbl sequenzialmente, una struttura in cui il movimento delle cellule può essere controllato lateralmente e longitudinalmente circonferenzialmente può essere ottenuto 15.
Qui si descrive due metodi di modifica per i nuovi impianti in titanio, utilizzando il loro comportamento idrofobico che può essereesteso a modifica di vari impianti porosi: i) formazione di gradienti di micropori entro i macroporosi con impianti di titanio idrofobe, polimeri sintetici ii) formazione di uno spesso strato di film polimerico sulla superficie dell'impianto che supporta la crescita cellulare e la formazione di rivestimento multistrati polielettrolita. Questi metodi possono essere usati in sequenza o separatamente. Essi forniscono strutture che garantiscono la migrazione controllata e organizzazione spaziale dei diversi tipi di cellule nei tessuti multicellulari 16,17. Per il caso specifico della trachea, il risultato desiderato per l'impianto sarebbe la colonizzazione da tessuto fibrovascolare entro i gradienti micropori senza restenosi e la formazione del rivestimento interno di cellule epiteliali ciliate sui multistrati polielettrolita.
Un modo per controllare l'integrazione della protesi è di fare piccoli interventi chirurgici nel periodo della loro integrazione con l'host in situ. Al fine di essere in grado tØ decidere la tempistica degli interventi, è importante disporre di informazioni sugli effetti sistemici della protesi. Proteina C-reattiva (CRP) è stato utilizzato per il monitoraggio di infezione e risposta infiammatoria in ambito clinico. Cromogranina A (CGA) può anche essere usato in modo simile e potrebbe fornire risultati più accurati per osservare il livello di infiammazione 18. Come un possibile modo di osservare l'integrazione impianto metallico in vivo, vi presentiamo una procedura di monitoraggio continuo di effetti sistemici degli impianti da parte caratterizzazione di campioni di sangue di animali con cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) e il successivo sequenziamento di proteine. Elaborazione di questo metodo può essere utilizzato per eludere analisi istologica end-point regolare. Taglio istologica di impianti metallici è un processo lungo, complicato e costoso e può essere effettuata solo in momenti specifici. Per questo motivo, ben progettato analisi del sangue forniscono informazioni circa la salute robusta impianto sarebbeessere possibili vie per diminuire la sperimentazione animale come richiesto dalle recenti norme UE in materia di sperimentazione animale.
I metodi qui presentati possono essere usati per migliorare le prestazioni di impianti metallici mediante funzionalizzazione o di avere un modo alternativo di monitoraggio degli impianti esistenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gradienti pori sono strumenti importanti in ingegneria tissutale di interfaccia e il sistema qui descritto possono essere usati da soli o in combinazione con impianti metallici a formare pori gradiente di studiare la migrazione cellulare. Il sistema non richiede alcuna impostazione supplementare o attrezzatura supplementare tranne sotto cappa per gestire solventi organici, così può essere applicato in laboratori di biologia. Polimeri simili come poli (acido glicolico) (PGA), poli (lattico-co-glicolico) acido (PLGA) e …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Andre Walder e Nicolas Perrin per la produzione di protesi in titanio, K. Benmlih per l'accumulo degli stampi in teflon e Dr. G. Prevost per il suo aiuto con la sperimentazione animale. Riconosciamo anche la Regione Alsazia e PMNA (Polo Materiaux et Nanoscienze d'Alsace) per il contributo finanziario.
Materials
| Reagent | |||
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 360481 | Toxic material, Strictly under chemical hood |
| PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g |
Sigma-Aldrich | 94829, 81273 | The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent. |
| PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate) | Novamatrix | 4200006 | Low viscosity(20-200 mPa.s) |
| Collagen type I (Bovine) | Symatese | CBPE2US100 | |
| Pen/Strep, Fungizone | Promocell | C42020 | |
| Genipin | Wako | 0703021 | |
| Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. | Bruker | MSCT | |
| Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0% | Sigma-Aldrich | 302031 | Hazardous Material, Please follow MSDS carefully |
| Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9% | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | C3100MP | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit | Genway Bio | GWB-9BF960 | |
| DMSO, Bioreagent, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Equipment | |||
| Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope | Bruker | ||
| Procise microsequencer | Applied Biosystems | ||
| Ultima 3000 HPLC system | Dionex | ||
| Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100 | Hitachi | ||
| Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 | Zeiss |
Table 1. List of Materials and Reagents.
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