Améliorer le taux de réussite de cristallisation de protéines par hasard Microseed Matrice dépistage
Summary
Nous décrivons ici une méthode générale pour le dépistage aléatoire de la matrice de microseed. Cette technique est illustrée à augmenter de manière significative le taux de dépistage des expériences de cristallisation de protéines de succès, de réduire le besoin pour l'optimisation, et de fournir un approvisionnement fiable de cristaux pour la collecte des données et expériences ligand-trempage.
Abstract
Aléatoire de dépistage de la matrice de microseed (RMM) est une technique de cristallisation de protéines dans lequel des cristaux de semences sont ajoutés aux écrans aléatoires. En augmentant la probabilité que les cristaux se développer dans la zone métastable du diagramme de phases d'une protéine, fils de cristallisation supplémentaires sont souvent obtenus, la qualité des cristaux obtenus peut être augmentée, et une bonne alimentation des cristaux pour les expériences de collecte de données et de trempage est fourni. Nous décrivons ici une méthode générale pour RMM qui peuvent être appliquées soit à goutte assis ou suspendus expériences de diffusion de vapeur à goutte, établis à la main ou à l'aide de la robotique de manipulation des liquides, dans 96 puits ou format de plateau de 24 puits.
Introduction
De sa demande initiale par Perutz, Kendrew et collègues dans la détermination des structures de l'hémoglobine et la myoglobine, les haut débit pipelines modernes automatisés de la génomique structurale consortiums, macromoléculaire cristallographie aux rayons X nous a offert un aperçu structurel sans précédent dans le monde de la protéine . Cette technique reste le procédé le plus largement applicable expérimental qui permet la visualisation directe de la structure des protéines à atomique, ou à proximité de résolution atomique (c'est à dire dans la gamme de 1-3 Å). Une condition préalable à la diffraction des rayons X pour être appliqué à une protéine est qu'elle doit d'abord être cristallisé, et c'est cette étape du processus qui reste le plus grand pas unique limitant la vitesse dans la détermination de la structure par des méthodes de diffraction 1, 2. Malgré des avancées significatives dans la compréhension du processus de cristallisation des protéines, et des améliorations majeures dans la qualité et la disponibilité des écrans de cristallisation,plateaux, et les technologies connexes, il reste impossible de prédire de façon fiable la probabilité de succès de cristallisation 3. Méthodes biochimiques et biophysiques peuvent être appliqués pour déterminer si une protéine d'intérêt affiche des caractéristiques favorables pour la nucléation et la croissance cristalline, c'est à dire qu'il est ainsi pliée, homogène, monodisperse, etc, cependant, ces indications en aucun cas fournir un indicateur définitif de cristallisation propension.
L'ensemencement a longtemps été censé être une méthode viable pour améliorer le nombre, la taille et la qualité des cristaux existants ou matériau cristallin 4-7. Cette approche est basée sur l'hypothèse qu'une condition qui favorise la nucléation des cristaux peut ne pas être optimal pour la croissance cristalline ultérieure et vice versa. En transférant le matériau nucléé d'un état à un autre, on peut tenter de découpler efficacement ces processus, donnant ainsi accès à un nouvel espace de cristallisation, encore inexploré,et par conséquent d'augmenter le taux de réussite globale d'une expérience de criblage. Méthodes établies ont été documentés pour (i) macroseeding, le transfert d'un monocristal dans son intégralité d'un état à un autre 8, (ii) l'ensemencement série, le transfert de matériau nucléé, généralement obtenu par l'application d'une pression directionnelle en utilisant par exemple la trichite d'un chat de la surface d'un cristal existant, suivi d'un passage ultérieur de la moustache grâce à une nouvelle goutte de cristallisation 9, et (iii) microseeding "classique", le transfert de cristal «graines», générés par la récolte broyé cristaux (ou cristallin matériel), dans des conditions similaires à celles qui ont donné les graines 10. Notamment tous les trois de ces méthodes sont longues et peu évolutive, certainement en comparaison à ce qui est réalisable avec la robotique moderne de cristallisation de manipulation des liquides. Ces facteurs ont contribué, à un certain niveau au moins, à la perception que les semencesING est une méthode pour être visité uniquement lorsque les autres approches ont échoué à porter ses fruits.
Aléatoire matrice microseeding (RMM) est une innovation méthodologique récente qui combine les avantages de microseeding traditionnelle avec ceux de criblage à haut débit et l'évolutivité 11-13. Cette approche repose sur la génération d'un stock de semences, produit à partir de matière cristalline nucléée, qui peut être répartie dans / sur chaque sub-well/coverslip dans un écran de cristallisation 96 condition standard. Cette méthode est applicable à tous les deux assis ou suspendus expériences de diffusion de vapeur à goutte, établis à la main ou à l'aide de la robotique de manipulation des liquides, dans 24 puits ou format de plaque de 96 puits. RMM a été démontré expérimentalement à augmenter de manière significative le taux de réussite de cristallisation, et produire des cristaux de meilleure qualité et la quantité de diffraction 11, 13, 14, et représente un outil novateur dans l'arsenal des cristallographes d'approches dans l'oNgoing effort vers la réussite de cristallisation. Nous décrivons ici une méthode générale pour RMM et fournissons des exemples de données illustrant l'efficacité de cette technique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, nous avons décrit une méthode générale pour RMM protéine dépistage de cristallisation. Nous avons démontré à l'aide de deux protéines de test un d'amélioration significative du taux de succès de la cristallisation en utilisant cette méthode. analyse de diffraction en utilisant le rayonnement synchrotron d'un sous-ensemble de cristaux générés en utilisant les RMM et les méthodes non-RMM a révélé peu de variation dans la qualité de diffraction entre les cristaux cultivés…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé en partie par le BBSRC (BB/1006478/1). PRR est le récipiendaire d'une bourse de recherche de l'Université Royal Society.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC 96 well crystallization trays | Molecular Dimensions Ltd | MD11-00-100 | Non-UV compatible, for screens established by robot |
| ClearView sealing sheets | Molecular Dimensions Ltd | MD6-01S | |
| Hen egg white lyzozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ~95% purity |
| Bovine liver catylase | Sigma-Aldrich | C9322 | >95% purity |
| Xylanase | Hampton Research | HR7-104 | |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | T7630 | |
| Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko | Sigma-Aldrich | P1512 | |
| JCSG-plus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-40 | For screens established by robot |
| PACT premier HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-36 | For screens established by robot |
| Morpheus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-47 | For screens established by robot |
| Crystal Phoenix liquid handling system | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
| Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| Binocular stereo microscope | Leica | M165C | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2646-100EA | |
| ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette | Starlab | S7100-0125 | |
| ErgoOne 2-20 μl pipette | Starlab | S7100-0221 | |
| ErgoOne 100-1000 μl pipette | Starlab | S7100-1000 | |
| JCSG-plus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-37 | For screens established by hand |
| PACT premier screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-29 | For screens established by hand |
| Morpheus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | For screens established by hand |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415-1EA | |
| CrystalClene coverslips 18 mm | Molecular Dimensions Ltd | MD4-17 | |
| 2 ml glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | Z722669 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-360 | |
| 24 well XRL crystallization tray | Molecular Dimensions Limited | MD3-11 | For screens established by hand |
| 30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0 |
Referencias
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