임의 Microseed 매트릭스 심사에 의해 단백질 결정화의 성공률을 향상
Summary
여기에서 우리는 무작위 microseed 매트릭스 심사하는 일반적인 방법에 대해 설명합니다. 이 기술은 크게, 단백질 결정화 스크리닝 실험의 성공률을 높일 최적화에 대한 필요성을 감소시키고, 데이터 수집 및 리간드 침지 실험에 대한 결정의 안정적인 공급을 제공하기 위해 도시된다.
Abstract
랜덤 microseed 매트릭스 스크리닝 (rMMS)는 종 결정은 임의의 화면에 추가되는 단백질 결정화 기술이다. 결정이 단백질의 상태도의 준 안정 영역에서 성장할 가능성을 증가시켜, 여분 결정화 리드 종종 생성 된 결정의 질이 향상 될 수 있고, 수득되며, 데이터 수집 및 침지 실험 결정체가 잘 공급이 제공된다. 여기에서 우리는 손으로 또는 96 – 웰 또는 24 웰 트레이 형식으로, 액체 처리 로봇을 사용하거나 설정 드롭 앉거나 매달려 드롭 증기 확산 실험 중 하나에 적용 할 수있다 rMMS에 대한 일반적인 방법을 설명합니다.
Introduction
페루 츠, Kendrew 및 구조 게놈 컨소시엄의 현대 높은 처리량 자동화 된 파이프 라인에, 헤모글로빈과 미오글로빈의 구조를 결정하는 동료에 의해 초기 응용 프로그램에서 고분자 X-선 결정학은 우리에게 단백질의 세계에 전례가없는 구조 살짝 여유있다 . 이 기술은 원자에서 단백질 구조의 직접적인 시각화를 허용하는 가장 널리 적용 실험 방법 유지하거나 (즉, 1-3 Å 범위) 해상도 원자 근처. 단백질에인가하는 X-선 회절을위한 전제 조건은 우선 결정화되어야한다는이며 회절 방법 1, 2에 의한 구조 분석에서 단일 최대 속도 – 제한 단계 유지 프로세스의이 단계이다. 트립 단백질 결정화 과정의 이해 및 결정화 화면의 품질 및 유용성에 큰 개선에 상당한 발전에도 불구하고,트레이 및 관련 기술, 그것을 확실하게 결정화 성공 3의 가능성을 예측하는 것은 여전히 불가능하다. 생화학 및 생물 물리학 적 방법이 관심을 표시하는 단백질은 결정 핵 생성과 성장에 유리한 특성, 즉, 잘 접힌, 균질, 단 분산 등의 여부를 평가하기 위해 적용 할 수 있습니다, 그러나, 어떠한 방식으로 이러한 분석은 결정의 최종적인 예측을 제공 성향.
시드는 오랫동안 존재 결정 또는 결정 성 물질 4-7의 숫자, 크기 및 품질을 향상시키기위한 가능한 방법으로 사칭되었다. 이 방법은 결정 핵 생성을 지원 조건이 후속의 결정 성장 및 그 반대를위한 최적이 아닐 수 있다는 전제에 기초한다. 다른 하나의 조건에서 핵 물질을 이동하여, 하나는 효과적으로 이러한 프로세스를 분리하는 새로운, 아직 미개척 결정화 공간에 따라서주는 접근을 시도 할 수 있습니다결과적으로 스크리닝 실험의 성공률을 증가시킬 수있다. 정해진 방법은 일반적으로 예를 들어 사용하는 지향성 압력의인가에 의해 얻어진 (I) macroseeding 다른 8 개의 조건에서 그 전체 단결정의 이동, (II)을 연속 시드, 핵 물질의 이동, 문서화 된 새로운 결정화 드롭 9, 그리고 (iii) "고전적인"microseeding 통해 수염의 후속 통과 한 다음 기존 결정의 표면에 고양이의 수염은, 수확에 의해 생성 된 결정 "씨앗"의 전송 결정 (또는 결정을 분쇄 씨앗 10를 산출하는 것과 유사한 조건에 자료). 특히 이러한 방법의 세 가지 확실히 현대 액체 처리 결정화 로봇과 달성 가능한 비교, 시간과 제대로 확장됩니다. 이러한 요소는 인식에, 적어도 어떤 수준에 기여하는 씨앗ING는 다른 접근이 결실을 맺기에 실패한 경우에만 방문 할 수있는 방법입니다.
임의의 행렬 microseeding (rMMS)는 높은 처리량 검사 및 확장 성을 11 ~ 13 그 전통 microseeding의 장점을 결합하여 최근의 방법 론적 혁신입니다. 이 방법은 표준 96 – 조건 결정화 화면 내의 각 sub-well/coverslip에 /로 분주 할 수있다 유핵 결정 성 물질에서 생산 된 종자 주식의 생성에 의존합니다. 이 방법은 두 손으로 또는 24도 또는 96도 트레이 형식으로, 액체 처리 로봇을 사용하거나 설정 드롭 증기 확산 실험을, 앉아 또는 교수형에 적용 할 수있다. rMMS 크게 결정화 성공률을 증가시키고, 더 큰 회절 질 및 양으로 18, 13, 14의 결정을 생성하기 위하여 실험적으로 증명하고, O에 접근 결정 학자 '병기 혁신적인 공구를 나타내고있다결정화 성공을 향한 노력을 ngoing. 여기에서 우리는 rMMS에 대한 일반적인 방법을 설명하고이 기술의 효과를 보여주는 샘플 데이터를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 논문에서 우리는 rMMS 단백질 결정화 검사에 대한 일반적인 방법을 설명했다. 우리는이 방법을 사용하여 두 개의 테스트 단백질 결정화 성공률에 상당한 향상을 사용하여 증명하고있다. rMMS 비 rMMS 방법을 사용하여 생성 된 결정의 서브 세트의 방사광을 사용하여 회절 분석은 이전의 저자는 좋은 품질 결정 rMMS 실험 11에서 성장할 가능성이있는 것으로보고되었지만, 방법을 사용…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 BBSRC (BB/1006478/1)에 의해 부분적으로 투자되었다. PRR은 왕립 학회 대학 연구 활동의받는 사람입니다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC 96 well crystallization trays | Molecular Dimensions Ltd | MD11-00-100 | Non-UV compatible, for screens established by robot |
| ClearView sealing sheets | Molecular Dimensions Ltd | MD6-01S | |
| Hen egg white lyzozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ~95% purity |
| Bovine liver catylase | Sigma-Aldrich | C9322 | >95% purity |
| Xylanase | Hampton Research | HR7-104 | |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | T7630 | |
| Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko | Sigma-Aldrich | P1512 | |
| JCSG-plus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-40 | For screens established by robot |
| PACT premier HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-36 | For screens established by robot |
| Morpheus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-47 | For screens established by robot |
| Crystal Phoenix liquid handling system | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
| Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| Binocular stereo microscope | Leica | M165C | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2646-100EA | |
| ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette | Starlab | S7100-0125 | |
| ErgoOne 2-20 μl pipette | Starlab | S7100-0221 | |
| ErgoOne 100-1000 μl pipette | Starlab | S7100-1000 | |
| JCSG-plus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-37 | For screens established by hand |
| PACT premier screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-29 | For screens established by hand |
| Morpheus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | For screens established by hand |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415-1EA | |
| CrystalClene coverslips 18 mm | Molecular Dimensions Ltd | MD4-17 | |
| 2 ml glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | Z722669 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-360 | |
| 24 well XRL crystallization tray | Molecular Dimensions Limited | MD3-11 | For screens established by hand |
| 30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0 |
Referencias
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