제작의 새로운 핀 인쇄 방법을 사용하여 졸 – 겔 파생 된 단백질을 첨가 마이크로 어레이를 개발하는 안내 자료를 심사 방식이 설명되어 있습니다. 이 방법은 비용 효율적인 작은 분자 검사에 사용되는 아세틸 콜린과 multikinase 마이크로 어레이의 개발을 통해 설명된다.
마이크로 어레이는 새로운 재료와 작은 분자 약물 리드의 발견을위한 높은 처리량 분석의 개발에 사용을 발견했습니다. 여기에 우리는 3 차원 단백질 마이크로 어레이 생성을 % s 적당하다 졸 – 겔 기반의 물질을 식별하는 유도 물질 스크리닝 방법을 설명합니다. 방법은 먼저, 마이크로 어레이로 인쇄 할 수있는 물질을 식별하는 최대 효소 활성의 유지에 따라 특정 효소 분석과 호환되는 사람들, 그리고 최적의 재료에있는 숫돌을 식별하여 재료의 수를 좁혀. 이 방법은 암에 관련된 네 가지 핵심 키나아제의 세트를 사용하여 아세틸 콜린과 다른 사용하여 두 개의 서로 다른 효소 분석, 하나에 적합한 마이크로 어레이를 개발하기 위해 적용됩니다. 각각의 경우에, 그것은 양적 작은 분자 스크리닝 분석 및 용량 의존적으로 억제 반응 곡선의 생산에 사용할 수있는 마이크로 어레이를 생성 할 수있었습니다. 중요한 기능은 많은 친구를 선별하기리얼 베스트 효소 활성의 마이크로 어레이 제작 및 유지를 모두 적합한 재료의 유형에 대한 정보를 생산. 재료 데이터를 최적의 고밀도 졸 – 겔 파생 된 마이크로 어레이를 조정에 필요한 기초 자료 요구에 대한 통찰력을 제공합니다.
마이크로 어레이는 분석 처리량을 증가시키기위한 방법으로 과학 공동체 내에서 인기를 얻고있다. 마이크로 어레이 기술의 개발은 1990 년대 중반 유전자 발현 1을 평가하기 때문에, 마이크로 어레이, 단백질 – 단백질, 단백질 – 작은 분자 상호 작용을 식별하는 고유 한 특성을 가진 새로운 물질을 찾기 위해 높은 처리량 분석의 개발에 사용을 발견했습니다. 2-5 더 최근에, 마이크로 어레이는 적절한 형광을 사용하여 마이크로 어레이 자체에 효소 활성과 억제의 손쉬운 측정을 허용하는 특정 물질이 단백질이 속은되는 내 3 차원 마이크로 어레이 요소를 생성, 기능 단백질을 고정화하는 데 사용되는 것을 특징으로 개발 된 기판 매출에 결합 분석. 5-10 중요한 것은, 이러한 마이크로 어레이는 높은 병렬 방식으로 함께 필요한 모든 화면 샘플에 대한 구성 요소 및 컨트롤을 포함하도록 설계 할 수 있습니다. 5,8 </ P>
단백질 마이크로 어레이의 초기 예는 일반적으로 공유 결합 첨부 고체 지원,에 단백질 고정화에 대한 표준 방법을 사용하여 제조 하였다, 11 궁합이 3 캡처 및 물리적 흡착. 12 바이오 고정화 이러한 방법에 필요한 증가 된 시료 농도와 가속 반응 속도론을 허용하지만 분석 소형화, 그들은 각각의 단점을 겪고 있습니다. 일반적으로, 모든 표면의 화학적 변형으로 인하여 고유의 생체 분자 기능의 감소, 활성 사이트에 대한 액세스를 방해, 또는 비 특정 고정으로 인해 잘못된 방향을 발생할 수 있습니다. 따라서, 생리 활성 물질의 증착의 증가 가능성이 인위적으로 표면에 생체 분자를 바인딩 할 필요로 인해 발생하는 반응에도 불구하고 모든 메소드 낮은 분석 감도 결과.
기능성 생리 활성 물질의 마이크로 어레이의 생산을위한 새로운 접근 방식은 단백질 도핑의 핀 출력을 통해서이다일반적으로 하나 기능화 유리 슬라이드 또는 마이크로 웰 플레이트의 각 우물이다 단단한 지지대 위에 실리카 졸. 졸 – 겔 과정 자체는 상온에서 수성 환경에서 일어나는, 그리고 내 13로드뿐만 아니라 여러 구성 요소의 함정 수사 높은 단백질을 허용, 인쇄 한 다음 3D 매트릭스 내에서 모함 생체 분자에 젤되어 액체 전구체 같은 마이크로 어레이 요소입니다. 졸 – 겔 파생 물질의 13,14 재봉은뿐만 아니라 다른 버퍼를 사용하는 (산도, 이온 강도)를 통해 수용성 요소를 변경하여 다른 실리카 전구체의주의 깊은 선택을 통해 수행하고 포용 할 수 있습니다 최적의 재료를 달성하기 위해 다양한 첨가제 (고분자, 작은 분자)의 특정 자연 갇힌되는 생리 활성 물질에 따라 달라집니다. 10
핀 출력을 통해 졸 – 겔 파생 된 단백질 마이크로 어레이의 개발과 관련된 잠재적 인 제한은핀 겔화하지 않고 인쇄 또는 한 번 표면에 인쇄 바람직하지 않은 속성 (재현이 자리 크기, 균열, 접착 불량, 분석 구성 요소와 호환되지 않는 가난한 단백질의 활동을)를 표시 할 수있는 졸 – 겔 기반 복합 재료를 식별해야합니다. 5 동시 이 매개 변수의 모든 최적화 접근 상기 자료는 새로이 설계 할 수 있습니다 배제 또는 직렬 방식으로 천천히 살펴 보았다. 반면에, 많은 천 또는 자료의 수만 무작위로 선별도 시간도 비용 효과적입니다.
이 문서에서는, 우리는 무작위 재료의 큰 숫자를 화면에 필요없는 단백질 마이크로 어레이의 제작에 적합한 재료를 신속하게 식별 할 수있는 감독 검사 방법을 설명합니다. 유도 방식을 사용하여, 마이크로 어레이 인쇄에 적합한 재료를 먼저 확인하는 작은 규모의 일련의 화면 뒤에 식별 졸 – 겔 materi에 파생 최적알 조합이이 균열없이 재현성 인쇄 주어진 분석과 호환 될 수 있습니다. 마지막으로, 최적의 재료는 최종적인 작은 분자 스크리닝 검사에서 효소 활성 및 성능의 유지에 따라 식별됩니다. 이 방법으로 최적의 재료는 몇백 분석 단계를 사용하여 여러 천 후보를 식별 할 수 있습니다. 우리는 고밀도 아세틸 콜린과 multikinase 마이크로 어레이 및 작은 분자 검사에 대한 이러한 마이크로 어레이의 사용을 모두 제작이 방법을 보여줍니다.
여기에 설명 된 방법론은 빠른 속도로 재료의 큰 숫자를 선별 할 필요없이 최적의 재료를 식별하기위한 시간과 비용 효과적인 절차를 제작, 연락처 프린터와 인쇄 졸 – 겔 파생 물질을 식별하기위한 가장 적합한 것으로 선정되었다. ~ 20,000 잠재 물질의 총, 그것은 혼자 겔화 시간을 기준으로 인쇄에 적합한 있었다 ~ 200 자료를 확인 할 수있었습니다. 이 크게 이후의 인쇄 시험을 위해 준비 될 필요가 물질의 수를 감소. 이러한 인쇄 자료는 다음 768 물자 슬라이드 조합의 총 4 슬라이드 표면에 인쇄되었다. 평균 한 자료 50 점 / 복제는 샘플 로딩, 현장 증착 및 핀 청소 등 2 ~ 3 분에 인쇄 할 수 있습니다. 그 중, 155 물질 또는 약 20 %가 솔루션의 이해 당 반점의 최대 개수를 인쇄 허용 재현 스폿 크기를 생산. 그것은 주목해야한다 4 SL의IDE의 표면이 테스트 자료는 순서대로 더 나은 인쇄 : 아민> 에폭시> 알데히드> PMMA, PMMA 슬라이드가 어떤 재료에 대한 유용한 배열을 생성하지 않았다. 이 가능성이 표면 코팅의 극성에 기인했다. 앞서 언급 한 슬라이드 표면의 비교, 더 극성 아민과 에폭시는 더 PMMA 슬라이드에 비해 수성 졸에 적합 하였다. 또한, 테스트 표면의, 아민 코팅 된 슬라이드 본드 음이온 졸을 입금에 대한 잠재적 인 양전하를 띤 표면을 제공합니다. 우리는 의심 실리카 슬라이드 졸이 표면을 따라 상호 작용 사이의 인터페이스에서 나노 입자. 에폭시 알데히드 슬라이드 표면은 모두 동일한 초기 충전 기반의 상호 작용이 부족하다. 최적의 자리 증착을 위해 그것은 매우 같은 Arrayit 같은 업체로부터 미리 코팅 된 슬라이드를 사용하는 것이 좋습니다. 사내 코팅이 좋지 현장 재현성 13으로 이어질 일치하지 않는 표면을 만들어, 어떤 경우에, 정량화 PROB로 이어질 수 있습니다LEMS. 동등한 중요성의 18 온도와 습도 자료의 "인쇄 적성"에 영향을줍니다. 온도 관련 효과에 더 자세한 연구가 수행되지 동안, 인쇄는 항상 실온에서 실시 (23 ± 3 ° C)이었다. 습도 (80 % 이상)도 작은 증착 볼륨 (0.7-2.3 NL)와 증발에 의한 불규칙한 형태의 증착을 방지하기 위해 인쇄 챔버 내에서 제어되었다.
자료 화면이 아프고 키니 아제, 단백질의 두 가지 유형의 근무 재료의 작은 집합 확인 된의 인쇄를 위해 특별히 최적의 졸 – 겔 파생 물질을 식별하는 방향으로 안내하는 동안. 사실, 키나제 마이크로 어레이 제작을 위해 식별 된 물질의 양이 SS + PVA + 글리세롤 기반으로했다, 두 물질은 아세틸 콜린 마이크로 어레이에 대해 선택한 26 물질에서 발견되었다. 이러한 "최적의"재료는 더 prote 개발을위한 일반적인 출발점을 제공 할 수이러한 조성물 중심에서 도핑 졸 – 겔 기반의 마이크로 어레이, 그리고 작은 화면은 마이크로 어레이 제작을위한 더 나은 재료를 식별 할 수 있습니다. 참고로 두 번째 점은 사용 된 효소의 중요성이다. 아세틸 콜린 (오히려 강력한 효소)의 경우, 분석 호환으로 식별 원래 66 자료 26 (또는 약 40 %)이 갇힌 아세틸 콜린의 활성을 유지했다. 하지만 더 민감한 키니 아제를 들어, 69 분석 호환 조성물 또는 물질의 약 3 %, 만 2 모든 키나아제의 활성을 유지 할 수 있었다. 다른 효소의 충분한 숫자가 결정적인 진술을 만들기 위해 연구되지 않은 있지만, 그것은 상대적으로 불안정한 효소가 최적화 어레이 제작은 mutliplexed 마이크로 어레이 제작을 허용하는 단백질의 넓은 범위를 모함 수있는 물질의 식별로 이어질 수 있습니다 나타납니다.
선택된 단백질의 독립, 인쇄 자료를 식별하기위한 주요 컷 – 오프 계수는 오랫동안 필요로했다자료 겔화 시간 (> 2.5 시간). SS 기반의 졸 – 겔 재료를 개발하면, 이온 교환 여과 후, 졸은 pH가 약 4이다, 있는지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 낮은 초기 산도와 졸은 효소 활성에 영향을 줄 수 있습니다. 19 조정은 SS에 DOWEX (이온 교환 수지)의 양 졸의 최종 pH를 변경할 수보다 낮은 중성 pH와 자료에 발생할 수 있습니다. 수지의 새로운 배치가 준비 될 때 SS에 수지의 비율은 프로토콜의 제 2의 절차에 따라 약 pH를 4로 졸을 생산하는만큼 조정해야합니다.
마찬가지로, 결정 DGS의 준비는 종종 생리 활성 물질의 포집을위한 DGS 기반 졸을 사용하는 경우 재료의 실패와 관련된 오류의 소스입니다. 자세히 여기에보고되지는 않았지만, 큰 관심은 polyglycerated 실리카를 생성 할 수 있습니다 특히 결정 DGS의 합성, 합성 과정에서 물의 존재를 피하기 위해 필요하는 동안주의 할 필요오히려 단량체 DGS보다 TES. 또한, DGS의 흡습 특성으로 인해, 결정 샘플은 건조 된 및 합성 후 한 6 개월 이내에 사용 저장합니다. 6개월 세 이상 결정 DGS도 산성 환경에서 초음파와 (때문에 부분적으로 응축 포리 규산염 물질)로 완전히 용해되지 않을 수 있습니다. 불완전 DGS 용해는 알려지지 통제 할 수없는 실리카 내용과, 따라서 덜 강력한 물질과 졸을 생산하고 있습니다.
연락처 인쇄 주목해야 할 중요한 점은 핀의 품질입니다. 손상되거나 잘못 취급 핀 (그림 9)는 인쇄되는 재료의 독립 재현 배열을 생성하지 않습니다. 이 부서 지거나 막혀 핀이 사용되지 않도록하기 위해 해부 현미경을 사용하여 핀의 품질을 확인하는 것이 좋습니다. 주의 처리는 핀이 긴 수명을 보장합니다. 핀의 자유로운 이동도 중요하다. 습기가 머리와 핀 사이의 프린트 헤드, 핀에 갇혀 경우올바르게 좌석 따라서 재료의 증착의 부족의 결과로, 표면에 적절한 접촉하지 않습니다하지 않습니다.
결론적으로, 우리는 고밀도 단백질을 첨가 핀 인쇄 된 마이크로 어레이 개발을위한 세부, 다단계 심사 방식을 제공하고 있습니다. 검사 더 집중 검사 한 다음 재료의 인쇄, 주어진 분석과 호환 효소 활성을 유지 할 수있는 물질을 식별 할 수 있도록 재료 특성의 최적화 (겔화 시간 및 인쇄) 포함됩니다. 이 안내 자료 심사 방식은 시간과 효율적인 고밀도 마이크로 어레이를 생산과 관련된 비용을 절감하기 위해 추가 마이크로 어레이 형식으로 적용 할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 단백질 마이크로 어레이의 개발에 도움 마리아 몬턴, 줄리 LEBERT, Jessamyn 작은, 신화 창 로라 Lautens 감사합니다. 저자는 또한이 작품 자금에 대한 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구위원회 (NSERC)을드립니다. 저자는 또한이 작품의 지원을위한 혁신과 온타리오 혁신 트러스트 캐나다 재단 감사합니다. JDB는 생 분석 화학 Biointerfaces에있는 캐나다 연구 의자를 보유하고 있습니다.
Reagent/Material | |||
Poly(vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Alderich | 360627 | 80% hydrolozyed, Mw 600 |
Polyethylene glycol 600 (PEG) | Sigma-Alderich | 87333 | |
Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Alderich | 482595 | 50% (w/w) solution in water |
Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH) | Gelest, Inc. | SIC2263.0 | 25% in water |
N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS) | Gelest, Inc. | SIT8189.0 | 50% in ethanol |
bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropylene oxide (MDSPPO) | Gelest, Inc. | SIB1660.0 | |
Methyltrimethoxysilane (MTMS) | Gelest, Inc. | SIM6560.1 | |
Bis(triethoxysiyly)ethane (Bis-TEOS) | Gelest, Inc. | SIB1817.0 | |
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Gelest, Inc. | SIA0610.0 | |
Glycerol | Sigma-Alderich | 49767 | |
D-Sorbitol | Sigma-Alderich | 240850 | |
D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Alderich | T9531 | |
Triton X-100 | Sigma-Alderich | X-100 | |
Nε-Acetyl-L-lysine | Sigma-Alderich | A4021 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Alderich | 154563 | |
HEPES | Sigma-Alderich | H3375 | |
Sodium hydroxide, 1.0 N | LabChem Inc. | LC24350-2 | |
Hydrochloric Acid, 1.0 N/0.1 N | LabChem Inc. | LC15300-2/LC152220-2 | |
Magnesium chloride | Sigma-Alderich | M8266 | |
Diglycerolsilane (DGS) | Prepared in laboratory | ||
Sodium silicate solution | Fisher Scientific | SS338-1 | |
Dowex 50WX8-100 ion exchance resin | Sigma-Alderich | 217492 | |
Acetylthiocholine iodide | Sigma-Alderich | 1480 | |
Acetylcholinesterase from Electrophorus electricus (electric eel) | Sigma-Alderich | C2888 | |
BODIPY FL L-Cystine | Invitrogen | B-20340 | |
Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Stain Kit | Invitrogen | P33706 | |
Adenosine 5'triphosphate disodium salt (ATP) solution | Sigma-Alderich | A6559 | |
MAP Kinase 2 (MAPK2) | EMD Millipore | 454850 | |
p38α/SAPK2a (T106M), active | EMD Millipore | 14-687M | |
Epidermal growth factor (EGFR) | EMD Millipore | Donated by Millipore | |
Glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) | EMD Millipore | 14-306 | |
Myelin basic protein (MBP) | EMD Millipore | Substrate for MAPK2 and p38α, Donated by Millipore | |
GSM | EMD Millipore | 12-533 | Substrate for GSK-3β |
Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y) | EMD Millipore | 12-440 | Substrate for EGFR |
Stealth pin | ArrayIt | SMP3 | |
Stealth pin | ArrayIt | SMP7 | |
Amine coated slides | ArrayIt | SMM2 | |
Aldehyde coated slides | ArrayIt | SMA2 | |
Exposy coated slides | ArrayIt | SME2 | |
Poly(methylmethacrylate) (PMMA) coated slides | Exakt Technologies Inc. | 41500 | |
0.2-μm syringe filter | PALL Life Sciences | 4612 | |
Equipment | |||
Virtek Contact Printer | BioRad | ||
Novaray Fluorescence Slide Imager | Alpha Innotech Corporation | ||
Desktop microarray centrifuge | ArrayIt | MHC110V | |
MilliQ Synthesis A10 | Millipore | Used to filter all water required for experiments |