Móvil en vivo de imágenes de Alphaherpes Virus Transporte anterógrada y Propagación
Summary
Imágenes de células vivas de las infecciones por virus alphaherpes permite el análisis de los eventos dinámicos de transporte dirigido y propagación intercelular. A continuación, presentamos metodologías que utilizan cepas virales recombinantes que expresan proteínas de fusión fluorescentes para facilitar la visualización de los conjuntos virales durante la infección de las neuronas primarias.
Abstract
Los avances en las técnicas de microscopía de fluorescencia de células vivas, así como la construcción de cepas virales recombinantes que expresan proteínas de fusión fluorescentes han permitido a la visualización en tiempo real del transporte y la propagación de la infección por el virus alphaherpes de las neuronas. La utilidad de las nuevas proteínas de fusión fluorescentes a la membrana viral, tegumento, y cápsidas, en conjunción con imágenes de células vivas, identificado conjuntos de partículas virales transportados dentro de los axones. Herramientas similares se han empleado con éxito para el análisis de la célula-célula repartidas de partículas virales para cuantificar el número y la diversidad de los viriones de transmisión entre las células. Es importante destacar que las técnicas de imágenes de células vivas del transporte y la propagación anterógrada producen una gran cantidad de información, incluyendo velocidades de las partículas de transporte, la distribución de las partículas, y los análisis temporales de la localización de la proteína. Junto a las técnicas genéticas virales clásicos, estas metodologías han proporcionado una visión críticaen importantes cuestiones mecánicas. En este artículo se describe en detalle los métodos de imagen que se desarrollaron para responder a las preguntas básicas de transporte de virus alphaherpes y propagación.
Introduction
La infección del sistema nervioso periférico (SNP) por alphaherpes virus tales como el virus del herpes simple (HSV) -1, -2, y el virus de la pseudorrabia (PRV) implica varios pasos complejos y altamente regulado durante todo el ciclo de vida viral. Transporte dentro de las neuronas del SNP es fundamental durante los acontecimientos de la infección viral primaria y posterior propagación inter-host. Los mecanismos moleculares que modulan dos componentes del ciclo de vida viral, el transporte dirigido de conjuntos virales de distancia desde los cuerpos celulares dentro de los axones (transporte anterógrado) y la transmisión posterior de los viriones a las células susceptibles (propagación anterógrada) son importantes para la comprensión del herpesvirus patogénesis.
El transporte y la salida de las partículas virales en las neuronas depende de montaje de un 1,2 virión infeccioso maduro. Ensayos previamente fijados, incluyendo inmunofluorescencia (IF) y microscopía electrónica (EM), se utilizaron para estudiar el estado de montaje de partículas y protinteracciones ein relacionados con el transporte y la propagación del virión 3-6. Sin embargo, la naturaleza dinámica de transporte de viriones y artefactos experimentales introducidas por fijación química confunde la interpretación de imágenes fijas 7,8. Recientemente, un número de proteínas de fusión viral-fluorescentes se han descrito para el VHS y PRV que tienen impactos insignificantes en la función de proteínas. Proteína Fluorescente Verde (GFP) y las proteínas fluorescentes rojas (mCherry o mRFP) fluoróforos a menudo se combina para permitir formación de imágenes de dos de los tres componentes estructurales de un virión maduro: cápside, tegumento, y glicoproteína 9-11. Imágenes de células vivas de transporte anterógrado con doble etiquetado virus visualiza el estado de ensamblaje de las partículas virales durante el transporte. Fluoróforo similares expresando cepas virales se utilizan para visualizar el número y la diversidad de los genomas virales siguientes propagación 12,13. Las propiedades de las proteínas fluorescentes (revisado en 14,15) afectan en gran medidala capacidad de visualizar conjuntos virales o celulares. Las propiedades intrínsecas de la proteína fluorescente, incluyendo la auto-interacciones y estabilidad, deben tenerse en cuenta al diseñar y probar nuevas fusiones de proteínas para la preservación de la funcionalidad de tipo salvaje.
En conjunción con fusiones de proteínas fluorescentes, dos bien caracterizados es sistemas de cultivo celular in vitro se emplean para la formación de imágenes en vivo de células de la infección por virus del herpes: disociado 16 y compartimentada 17 (Figura 1A) neuronas de los ganglios cervicales superiores de rata (SCG). En ambos sistemas, embrionario SCG se diseccionan, disociado de los cuerpos celulares individuales, y se sembraron es el cultivo in vitro 18. Las neuronas SCG son parte del sistema nervioso autónomo y pueden ser fácilmente cultivadas y diferenciadas por el factor de crecimiento neuronal (NGF) en una madura estado polarizado ex vivo. Neuronas SCG disociadas forman una extensa red de axones que permite fo la visualización de partículas virales que sean sometidos a transporte anterógrado 6. Culturas SCG en compartimientos proporcionan aislamiento de fluidos del cuerpo de las células neuronales (compartimento S) y terminales de axones distales (compartimiento N) 19. Una serie de protocolos detallados para la construcción y el uso de las neuronas compartimentada con 20 originales o modificadas Campenot cámaras 17 se han publicado con anterioridad. Aislamiento neumático permite la infección selectiva de los cuerpos de las células neuronales y la detección de viriones progenie después del transporte a terminales de axones aislados. Plating células epiteliales a través de los terminales antes de la infección proporciona células receptoras para la propagación de la infección viral.
Hay muchos elementos esenciales importantes para toda la experimentación imágenes de células vivas, pero los más relevantes para nuestros protocolos son: la adquisición automatizada de imagen, la iluminación fluorescente, la velocidad de formación de imágenes, y el control del medio ambiente. Para todos los experimentos de imagen, utilizamosun,, microscopio de epifluorescencia iluminación automatizado invertida (Figura 1B). El microscopio se basa en la base de Nikon Eclipse Ti y emplea una serie de sistemas motorizados controlados por el ordenador para reconfigurar rápidamente el microscopio durante la adquisición de imágenes automatizado. Para la iluminación de fluorescencia, se utiliza un amplio espectro lámpara de arco de mercurio que puede ser atenuado con filtros de densidad neutra a lo largo de la trayectoria de iluminación. Filtros de excitación limitan el espectro de la iluminación fluorescente y cuando se combina con espejos dicroicos múltiples pasadas y filtros de emisión de fluorescencia visualizar compuestos fluorescentes específicas. Los filtros de excitación y emisión se montan en ruedas independientes, cambio rápido de filtro para permitir una rápida adquisición secuencial de diferentes canales fluorescentes. La velocidad de adquisición de la imagen se ve reforzada con una cámara EM-CCD sensible y rápido, útil para la detección de señales de baja intensidad y corta imagen tiempos de lectura. Control ambiental de la microscOpe se consigue con una tapa etapa se calienta incubadora y un calentador de lente de objetivo de mantener las muestras a temperaturas elevadas mientras se pasa un ambiente humidificado y CO 2 enriquecido en la incubadora. El microscopio se mantiene en una habitación oscura con una temperatura ambiente mantenida cerca de 25 ° C y la luz fuera minimizada con cortinas en todas las ventanas. Los protocolos siguientes describen el uso de este sistema para el transporte anterógrado y ensayos de propagación.
Una serie de alternativas existen para el control de las variables de imágenes de células vivas. El control de la configuración de microscopía se puede realizar manualmente o por medio de sistemas automatizados que dependen de software propietario. Iluminación de fluorescencia se puede lograr con fuentes de láser de halógeno, o LED. La velocidad de formación de imágenes es modificado por la velocidad de conmutación de filtro y el tiempo para visualizar la señal con el sistema de detección emparejado. El control ambiental se puede lograr con hardware especializado en la millasetapa copio, recinto de la totalidad o parte del microscopio en una caja calentado y humidificado, o mediante la elevación de la temperatura de la habitación donde se llevará a cabo la microscopía. Cada una de estas alternativas tiene ventajas y desventajas relacionadas con el coste y el rendimiento.
En el protocolo posterior, que detalle el uso de imágenes de células vivas para estudiar el transporte rápido anterógrada y la propagación de los virus alphaherpes anterógrada a través de la utilización de cepas virales recombinantes. Imágenes de células vivas en tiempo real visualiza la cápside, tegumento, y / o glicoproteína co-localización de estructuras dinámicas que experimentan transporte dentro de los axones 11. Imágenes timelapse noche de cultivos neuronales compartimentadas visualiza axonal salida del virión y la infección de células susceptibles 12. Los protocolos que aquí se presentan se han optimizado para su uso con el sistema de imagen en particular, sino que se presenta en términos generales en relación con los cuatro elementos de imágenes de células vivas. En la discusión quevoluntad más detalle algunos de la optimización que es necesario para la experimentación con éxito.
Protocol
Representative Results
Discussion
El objetivo de imágenes de células vivas es la observación de los procesos biológicos que ocurren sin una alteración significativa en el acto de la observación. Este objetivo se logra mediante la optimización de tres variables: el control del medio ambiente, la velocidad de formación de imágenes, y la iluminación de fluorescencia. Estas variables interdependientes deben ser equilibradas para lograr condiciones de la imagen viables. Los protocolos presentados utilizan condiciones específicas para producir los …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LSA y RK son apoyados por los EE.UU. Institutos Nacionales de Salud subvenciones NS033506 R37-16 y R01 NS060699-03. MPT fue apoyada por una beca de investigación postdoctoral Sociedad Americana del Cáncer (PF-10-057-01-MPC). El asesoramiento y el conocimiento del Dr. Matthew Lyman y el Dr. Oren Kobiler fueron fundamentales en el diseño de la configuración del microscopio y los métodos de imágenes de células vivas. También extendemos gracias a Neal Barlow y Brian T. Kain de Nikon instrumentos para su asistencia técnica en la adquisición, instalación y funcionamiento del microscopio.
Materials
| Name | Company | Catalogue number |
| 35 mm glass bottom culture dish | MatTek Corporation; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81156 |
| Microscope body | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti |
| Motorized microscope X-Y stage | Prior Scientific; Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top |
| Motorized filter wheels | Prior Scientific | HF110 10 position filter wheel |
| Fluorescent illumination source | Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada | X-Cite 120Q |
| Multi-band Fluorescence filter sets | Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad – ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry – ET |
| EM-CCD camera | Andor Technology USA; South Windsor, CT | iXon3 897 |
| Chamlide stage top environmental incubator | Live Cell Instruments; Seoul, South Korea | TC-L-10 |
| Objective lens heater | Bioptecs; Butler, PA | 150803 Controller 150819-12-08 Heater |
| Analysis software | Nikon Instruments Inc.; Melville, NY | NIS Elements |
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