الإجراء لتنمية متعدد عمق التعميم مستعرضة Endothelialized Microchannels على واحد في رقاقة
Summary
وقد تم تطوير منصة microchannels على واحد في رقاقة من قبل مجموعة من الفوتوليتوغرافية تقنية reflowable مقاومة للضوء، والطباعة الحجرية الناعمة، وعلى microfluidics. منصة microchannels endothelialized يحاكي ثلاثية الأبعاد (3D) هندسة في الجسم الحي microvessels، يعمل تحت رقابة تدفق نضح المستمر، ويسمح للتصوير عالية الجودة في الوقت الحقيقي، ويمكن تطبيقها للبحوث الاوعية الدموية الدقيقة.
Abstract
وقد تركزت الجهود على تطوير في فحوصات المختبر لدراسة microvessels لأن الدراسات على الحيوانات في الجسم الحي تستغرق وقتا طويلا أكثر، ومكلفة، والمراقبة والقياس الكمي هي صعبة للغاية. ومع ذلك، التقليدية في المختبر فحوصات microvessel لها حدود عندما تمثل في الجسم الحي microvessels فيما يتعلق ثلاثي الأبعاد (3D) الهندسة، وتوفير تدفق السوائل المستمر. باستخدام مزيج من الفوتوليتوغرافية تقنية reflowable مقاومة للضوء، والطباعة الحجرية الناعمة، وعلى microfluidics، قمنا بتطوير متعدد عمق دائرية endothelialized مستعرضة microchannels على واحد في رقاقة، الذي يحاكي الهندسة 3D من microvessels في الجسم الحي ويعمل تحت نضح المستمر للرقابة التدفق. تم استخدام مقاومة للضوء reflowable إيجابية لافتعال القالب الرئيسي مع شبكة متناهية مستعرضة نصف دائري. من المواءمة والربط بين الاثنين polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels REPLicated من القالب الرئيسي، تم إنشاء شبكة متناهية أسطواني. يمكن للأقطار و microchannels يكون تسيطر عليها بشكل جيد. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت السري الوريد الخلايا الأولية البطانية الإنسان (HUVECs) المصنفة داخل الرقاقة أن الخلايا تصطف على السطح الداخلي للو microchannels تحت نضح رقابة دائمة لفترة زمنية ما بين 4 أيام إلى 2 أسابيع.
Introduction
Microvessels، كجزء من نظام الدورة الدموية، وتوسط التفاعلات بين الدم والأنسجة، ودعم الأنشطة الأيضية، وتحديد المكروية الأنسجة، وتلعب دورا حاسما في العديد من الظروف الصحية والمرضية. خلاصة من microvessels وظيفية في المختبر يمكن أن توفر منبرا لدراسة الظواهر الأوعية الدموية المعقدة. ومع ذلك، التقليدية في المختبر microvessel المقايسات، مثل البطانية المقايسات خلية الهجرة، البطانية المقايسات تشكيل أنبوب، والجرذان والفئران الأبهر المقايسات حلقة، غير قادر على إعادة إنشاء في الجسم الحي microvessels فيما يتعلق ثلاثي الأبعاد (3D) الهندسة والتحكم في التدفق المستمر 1-8. دراسات من microvessels باستخدام نماذج حيوانية والمقايسات في الجسم الحي، مثل القرنية فحص الأوعية الدموية، فرخ مشيمائي غشاء فحص الأوعية الدموية، ومقايسة Matrigel المكونات، هي أكثر استهلاكا للوقت، وارتفاع في التكلفة، مما يشكل تحديا فيما يتعلق المراقبة وquantifications، ورفع القضايا الأخلاقية 1، 9-13.
وقد مكنت التطورات في micromanufacturing وتقنيات شرائح ميكروفلويديك مجموعة متنوعة من نظرة ثاقبة العلوم الطبية الحيوية بينما الحد من تكاليف التجريبية العالية والتعقيدات المرتبطة مع الحيوانات في الجسم الحي والدراسات 14، مثل الظروف البيولوجية السيطرة عليها بسهولة وبإحكام والبيئات فلويديك الحيوية، والتي لن يكون كان ممكن مع التقنيات التقليدية macroscale.
هنا، فإننا نقدم هذا النهج لبناء endothelialized microchannels على واحد في رقاقة الذي يحاكي الهندسة 3D في الجسم الحي من microvessels ويعمل تحت رقابة تدفق نضح المستمر باستخدام مزيج من الفوتوليتوغرافية تقنية reflowable مقاومة للضوء، والطباعة الحجرية الناعمة، وعلى microfluidics.
Protocol
Representative Results
Discussion
1. القالب الرئيسي تلفيق
واحدة من المبادئ التوجيهية لتصميم وقياس الأشكال الأوعية الدموية يعرف باسم قانون موراي 16، التي تنص على أن توزيع بأقطار السفينة في جميع أنحاء الشبكة تحكمه النظر الطاقة الحد الأدنى. كما تنص الاتفاقية …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث جزئيا من قبل مؤسسة العلوم الوطنية (NSF 1227359)، وفو برنامج EPSCoR بتمويل من مؤسسة العلوم الوطنية (EPS-1003907)، مكتب ADVANCE وفو برعاية مؤسسة العلوم الوطنية (1007978)، ووفو PSCoR، على التوالي. تم إنجاز العمل في التصنيع الدقيق وفو مرافق البحوث المشتركة (مرافق غرف الأبحاث) وميكروفلويديك البحوث الخلوية تكاملية على مختبر رقاقة (رقاقة مختبر) في جامعة وست فرجينيا. وقد تم التصوير متحد البؤر في وفو مرفق التصوير المجهر.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Reflow Photoresist | AZ Electronic Materials | AZP4620 | |
| Developer | AZ Electronic Materials | AZ 400K | |
| PDMS | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| MCDB 131 Culture Medium | Invitrogen | 10372-019 | |
| NacBlue Nuclei Staining | Invitrogen | H1399 | |
| PKH Red Stain | Sigma | MINI26 and PKH26GL | |
| Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14040-133 | |
| HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
| Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25300-062 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | |
| PDMS Curing Agent | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-501F | |
| Diluent C | Sigma | CGLDIL | |
| Hoechst33342 | Invitrogen, Molecular Probes | R37605 | |
| Dextran | Sigma | 95771 | |
| 3.5% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 15710-S | |
| Equipment | |||
| Spinner | Laurell Technologies Corporation | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Desiccator | BelArt Products | 999320237 | |
| Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Syringe Pump System | Harvard Apparatus | PHD Ultra | |
| Laminar Biosafety Hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Planetary Centrifugal Mixer | Thinky | ARE-310 | |
| Isotemp Oven | Fisher Scientific | 13-246-516GAQ | |
| Optical Microscope | Zeiss | Invertoskop 40C | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Hotplate | Barnstead/Thermolyne Cimarec | SP131635 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 |
Referencias
- Adair, T. H. . Angiogenesis: Integrated systems physiology: from molecule to function to disease. , (2011).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, 172-183 (2007).
- Smith, E. J., Staton, C. A. Tubule formation assays. Angiogenesis assays: A critical appraisal of current techniques. , 65-87 (2006).
- Nakatsu, M. N., Davis, J. J., Hughes, C. C. W. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab. Invest. 63, 115-122 (1990).
- Aplin, A. C., Fogel, E., Zorzi, P., Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 119-136 (2008).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: A quarter century of search and discovery. J. Cell. Mol. Med. 13, 4113-4136 (2009).
- Griffith, L. G., Swart, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 211-224 (2006).
- Folkman, J. History of angiogenesis. Angiogenesis: An integrative approach from science to medicine. , (2008).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: A critical overview. Clin. Chem. 49, 32-40 (2003).
- Auerbach, R., Akhtar, N., Lewis, R. L., Shinners, B. L. Angiogenesis assays: Problems and pitfalls. Cancer Metastasis Rev. 19, 167-172 (2000).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Staton, C. A., Stribbling, S. M., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int. J. Exp. Pathol. 85, 233-248 (2004).
- Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-Chip: A focus on compartmentalized microdevices. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
- Huang, Z., Li, X., Martins-Green, M., Liu, Y. Microfabrication cylindrical microfluidic channel networks for microvascular research. Biomedical Microdevices. 14 (5), 873-883 (2012).
- Murray, C. D. The physiological principle of minimum work applied to the angle of branching of arteries. J. Gen. Physiol. 9 (6), 835-841 (1926).
- Zamir, M., Medeiros, J. A. Arterial branching in man and monkey. J. Gen. Physiol. 79, 353-360 (1982).
- Gafiychuk, V. V., Lubashevsky, I. A. On the principles of the vascular network branching. J. Theor. Biol. 212, 1-9 (2001).
- Sherman, T. F. On connecting large vessels to small. The meaning of Murray’s law. J. Gen. Physiol. 78 (4), 431-453 (1981).
- Kamiya, A., Bukhari, R., Togawa, T. Adaptive regulation of wall shear stress optimizing vascular tree function. Bull Math Biol. 46 (1), 127-137 (1984).
- LaBarbera, M. Principles of design of fluid transport systems in zoology. Science. 249, 992-1000 (1990).
- Emerson, D. R., Cieslicki, K., Gu, X., Barber, R. W. Biomimetic design of microfluidic manifolds based on a generalized Murray’s law. Lab Chip. 6, 447-454 (2006).
- Lu, H., Koo, L. Y., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal. Chem. 76, 5257-5264 (2004).
- Shevkoplyas, S. S., Gifford, S. C., Yoshida, T., Bitensky, M. W. Prototype of an in vitro model of the microcirculation. Microvasc. Res. 65, 132-136 (2003).
- Kaihara, S., Borenstein, J., et al. Silicon micromachining to tissue engineer branched vascular channels for liver fabrication. Tissue Eng. 6, 105-117 (2000).
- Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 281 (3), L529-L533 (2001).
- Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
- Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1 (8), 759-766 (1990).
- Schilling, A., Merz, R., Ossmann, C., Herzig, H. P. Surface profiles of reflow microlenses under the influence of surface tension and gravity. Opt. Eng. 39 (8), 2171-2176 (2000).
- Young, B., Heath, J. W. . Wheater’s functional histology: A text and colour atlas. , (2000).
- O’Neill, F. T., Sheridan, J. T. Photoresist reflow method of microlens production. Part 1: Background and experiments. Optik Int. J. Light Electron Opt. 113, 391-404 (2002).
- de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Rev. Mod. Phys. 57, 827-863 (1985).
- Elias, H. G. . An Introduction to Polymer Science. , (1997).
- Voinov, O. V. Dynamic edge angles of wetting upon spreading of a drop over a solid surface. J. Appl. Mech. Tech. Phys. 40, 86-92 (1999).
- Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1, 759 (1990).
- Jay, T. R., Stern, M. B. Preshaping photoresist for refractive microlens fabrication. Opt. Eng. 33, 3552-3555 (1994).
- Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The Study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
- Chien, S., Li, S., Shyy, Y. J. Effects of mechanical forces on signal transduction and gene expression in endothelial cells. Hypertension. 31, 162-169 (1998).
- Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
- Lee, E. J., Vunjak-Novakovic, G., Wang, Y., Niklason, L. E. A biocompatible endothelial cell delivery system for in vitro tissue engineering. Cell Transplant. 18, 731-743 (2009).
- Lee, E. J., Niklason, L. E. A novel flow bioreactor for in vitro microvascularization. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 1191-1200 (2010).
- Chau, L., Doran, M., Cooper-White, J. A novel multishear microdevice for studying cell mechanics. Lab Chip. 9, 1897-1902 (2009).
- Meeson, A., Palmer, M., Calfon, M., Lang, R. A relationship between apoptosis and flow during programmed capillary regression is revealed by vital analysis. Development. 122, 3929-3938 (1996).
- Van Royen, N. J., Piek, J., Schaper, W., Bode, C., Buschmann, I. Arteriogenesis: mechanisms and modulation of collateral artery development. J. Nucl. Cardiol. 8, 687-693 (2001).
- Schaper, W. Therapeutic arteriogenesis has arrived. Circulation. 104 (17), 1994-1995 (2001).
- Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovas. Res. 87 (2), 320-330 (2010).
- Potter, C. M., Lundberg, M. H., et al. Role of shear stress in endothelial cell morphology and expression of cyclooxygenase isoforms. Arterioscler. Thromb. Vasc Biol. 31, 384-391 (2011).
- Montesano, R. In vitro rapid organization of endothelial cells into capillary-like networks is promoted by collagen matrices. J. Cell Biol. 97, 1648-1652 (1983).
- Darland, D. C., D’Amore, P. A. TGF beta is required for the formation of capillary-like structures in three-dimensional cocultures of 10T1/2 and endothelial cells. Angiogenesis. 4 (1), 11-20 (2001).
- Lawley, T. J., Kubota, Y. Induction to morphologic differentiation of endothelial cells in culture. J. Invest. Dermatol. 93, 59S-61S (1989).
- Kanzawa, S., Endo, H., Shioya, N. Improved in vitro angiogenesis model by collagen density reduction and the use of type III collagen. Ann. Plast. Surg. 30, 244-251 (1993).
- Davis, G. E., Bayless, K. J., Mavila, A. Molecular basis of endothelial cell morphogenesis in three-dimensional extracellular matrices. Anat. Rec. 268, 252-275 (2002).
- Velazquez, O. C., Snyder, R., Liu, Z., Fairman, R. M., Herlyn, M. Fibroblast-dependent differentiation of human microvascular endothelial cells into capillary-like 3-dimensional networks. FASEB J. 16, 1316-1318 (2002).
- Donovan, D., Brown, N. J., Bishop, E. T. Comparison of three in vitro human “angiogenesis” assays with capillaries formed in vivo. Angiogenesis. 4, 113-121 (2001).
- Tang, D. G., Conti, C. J. Endothelial cell development, vasculogenesis, angiogenesis, and tumor neovascularization: an update. Semin. Thromb. Hemost. 30, 109-117 (2004).
- Takayama, S., McDonald, J. C., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5545-5548 (1999).
- Cho, B. S., Schuster, T. G., et al. Passively driven integrated microfluidic system for separation of motile sperm. Anal. Chem. 75, 1671-1675 (2003).
- Parsa, H., Upadhyay, R., Sia, S. K. Uncovering the behaviors of individual cells within a multicellular microvascular community. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (12), 5133-5138 (2011).
