Usando Click Química para medir el efecto de la infección viral en el Host-Cell ARN Síntesis
Summary
Este método describe el uso de la química clic para medir los cambios en la transcripción de la célula huésped después de la infección con el virus de la fiebre del Valle del Rift (RVFV) cepa MP-12. Los resultados se pueden visualizar a través de microscopía de fluorescencia cualitativamente o cuantitativamente obtenerse a través de citometría de flujo. Este método es adaptable para su uso con otros virus.
Abstract
Muchos virus de ARN han desarrollado la capacidad para inhibir la transcripción célula huésped como un medio para eludir las defensas celulares. Para el estudio de estos virus, por lo tanto, es importante disponer de una manera rápida y fiable de medición de la actividad transcripcional en las células infectadas. Tradicionalmente, la transcripción se ha medido ya sea por la incorporación de nucleósidos radiactivos tales como 3H-uridina seguido por la detección mediante autorradiografía o recuento de centelleo, o la incorporación de análogos halogenados tales como uridina 5-bromouridina (BRU) seguido de la detección a través de inmunotinción. El uso de isótopos radiactivos, sin embargo, requiere un equipo especializado y no es factible en una serie de entornos de laboratorio, mientras que la detección de BrU puede ser engorroso y puede sufrir de baja sensibilidad.
La química clic desarrollado recientemente, que consiste en una formación de triazol catalizada por cobre de una azida y un alquino, ahora proporciona un rápido y highly alternativa sensible a estos dos métodos. Haga clic en la química es un proceso de dos pasos en el que el ARN nacientes se etiqueta por primera incorporación de la uridina análogo 5-etiniluridina (UE), seguido por la detección de la etiqueta con una azida fluorescente. Estos azidas están disponibles como varios fluoróforos diferentes, lo que permite una amplia gama de opciones para la visualización.
Este protocolo describe un método para medir la supresión transcripcional en células infectadas con el virus de la fiebre de Rift Valley (RVFV) cepa MP-12 usando química clic. Al mismo tiempo, la expresión de proteínas víricas en estas células se determina por inmunotinción intracelular clásica. Los pasos 1 a 4 detalle un método para visualizar la represión transcripcional a través de microscopía de fluorescencia, mientras que los pasos del 5 al 8 de detalle un método para cuantificar la represión transcripcional mediante citometría de flujo. Este protocolo es fácilmente adaptable para su uso con otros virus.
Introduction
Tradicionalmente, la actividad transcripcional se ha medido mediante la incorporación de cualquiera radiactivo (3 H-uridina) 1 o halogenados (BRU) 2 nucleósidos en ARN nacientes. Estos análogos de uridina son absorbidos por las células, convertidos en uridina-trifosfato (UTP) a través de la vía de recuperación de nucleósido, y posteriormente incluidas en los ARN recientemente sintetizado. 3 H-uridina pueden ser detectados por autorradiografía, que puede llevar mucho tiempo, o de centelleo contando, que requiere un equipo especializado. Por otra parte, el uso de isótopos radiactivos puede no ser práctico en una serie de entornos de laboratorio, incluidos los laboratorios de alta contención de seguridad de la biotecnología. BrU se puede detectar a través de inmunotinción con anticuerpos anti-Bru, que pueden requerir la permeabilización áspera para garantizar el acceso del anticuerpo al núcleo o desnaturalización parcial de ARN, como la estructura secundaria del ARN podría ser un impedimento estérico para la unión de anticuerpos.
_content "> El protocolo descrito aquí utiliza el Click recientemente desarrollado clic química 3 para medir la actividad transcripcional en las células infectadas con la cepa RVFV MP-12. química se basa en un cobre altamente selectiva y eficiente (I) catalizada por reacción de cicloadición entre un alquino y un resto azida 4,5. En este protocolo, ARN naciente en las células infectadas se etiqueta primero a través de la incorporación de uridina análogo de la UE. En un segundo paso, que se incorpora a la UE se detecta a través de la reacción con una azida fluorescente. Las principales ventajas de este método son (1) que no requiere el uso de isótopos radiactivos y (2) que no requiere la permeabilización dura o desnaturalización del ARN. Con un peso molecular de menos de 50 Da, el acceso de la azida fluorescente no esté impedido por el insuficiente estructura secundaria permeabilización o ARN. Además, los investigadores no están limitados en su elección de anticuerpos primarios cuando la combinación de la detección de ARN con una claseinmunotinción ical para las proteínas virales.Dos diferentes métodos se describen en este protocolo: uno para la visualización de la transcripción a través de microscopía de fluorescencia (pasos 1-4), y uno para la cuantificación de la transcripción a través de citometría de flujo (pasos 5-8). Ambos de estos métodos cosechadora etiquetado de ARN naciente con una inmunotinción intracelular de proteínas virales, lo que permite una correlación entre la actividad transcripcional y la infección viral en una base de celda por celda.
Los autores han utilizado con éxito el protocolo que se describe aquí para determinar la actividad transcripcional en las células infectadas con la cepa RVFV MP-12 6, las células infectadas con diferentes MP-12 mutantes 7,8, 9, y las células infectadas con el virus Toscana (TOSV) 10. El protocolo descrito aquí puede ser fácilmente adaptado para el uso con diferentes virus y tiene el potencial de ser modificado para incluir la tinción de inmunofluorescencia de las proteínas virales o celulares específicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo proporcionado describe un método para medir el efecto de la infección viral en la transcripción de la célula huésped a través de la incorporación de uridina análogo de la UE en el ARN nacientes. Este método tiene varias ventajas sobre los métodos anteriores: es rápido, sensible, y no se basa en el uso de isótopos radiactivos. Además, el método puede ser adaptado para producir los datos cualitativos a través de microscopía de fluorescencia o de datos cuantitativos a través de citometría de …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos RB Tesh para proporcionar el ratón policlonal anti-RVFV antisuero y M. Griffin del UTMB Citometría de Flujo Core Facility para ayudar con la citometría de flujo. Esta labor fue apoyada por 5 U54 AI057156 a través del Centro de Excelencia de la Región Occidental, NIH subvención R01 AI08764301, y la financiación del Centro Sealy para el Desarrollo de Vacunas de UTMB.BK fue apoyado por el James W. McLaughlin Fondo de Becas en UTMB.OL fue apoyado por R. Hilleman Early-Stage Premio Investigador Carrera Maurice.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ethynyl-uridine | Berry & Associates | PY 7563 | dissolve in DMSO for 100 mM stock |
| 12-mm round coverslips | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| 5 ml polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Actinomycin D (ActD) | Sigma | 9415 | dissolve in DMSO for 10 mM stock |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz | sc-2323 | |
| CuSO4 | Sigma | C-8027 | dissolve in H2O for 100 mM stock |
| DAPI | Sigma | D-9542 | dissolve in H2O for 5 mg/ml stock |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled) | Invitrogen | A10270 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled) | Invitrogen | A10277 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A-5960 | dissolve in H2O for 500 mM |
| paper filter | VWRbrand | 28333-087 | |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| poly-L-lysine (MW ≥ 70000) | Sigma | P1274 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Trizma base | Sigma | T-1503 | dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| Fluorescence Microscope | e.g. Olympus IX71 | ||
| Flow Cytometer | e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa |
Referencias
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