تصف المادة هنا طريقة تم تطويرها للحفاظ على بنية الكروماتين ثلاثية الأبعاد للخلايا الجرثومية الخصية. وقد أطلق على هذا الأسلوب الشريحة ثلاثية الأبعاد (3D). هذه الطريقة تحسن الحساسية للكشف عن الهياكل شبه النووية وتنطبق على الفلورة المناعية والحمض النووي وفلور الحمض النووي الريبي في التهجين الموقعي (FISH).
أثناء تمايز الخلايا الجرثومية الخصية ، يتغير هيكل الكروماتين النووي بشكل ديناميكي. يصف التالي طريقة مصممة للحفاظ على ترتيب الكروماتين ثلاثي الأبعاد للخلايا الجرثومية الخصية الموجودة في الفئران؛ تم وصف هذا الأسلوب كطريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد). في هذه الطريقة ، يتم التعامل مباشرة مع أنابيب الخصية مع خطوة permeabilization أن يزيل المواد السيتوبلازمية ، تليها خطوة التثبيت الذي يصلح المواد النووية. ثم يتم فصل الأنابيب، وتعليق الخلية هو cytospun، والخلايا تلتزم الشرائح. هذه الطريقة تحسن الحساسية تجاه الكشف عن الهياكل دون النووية وتنطبق على الفلورة المناعية والحمض النووي وفلور الحمض النووي الريبي في التهجين الموقعي (FISH) والجمع بين طرق الكشف هذه. كمثال على تطبيق محتمل لأسلوب الشريحة ثلاثية الأبعاد، يظهر جهاز COT-1 RNA FISH للكشف عن الحمض النووي الريبي الوليد. تسهل طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد الفحص التفصيلي للعلاقات المكانية بين بنية الكروماتين والحمض النووي والحمض النووي الريبي أثناء تمايز الخلايا الجرثومية الخصية.
في الخصية، الخلايا الجرثومية تفرق من الحيوانات المنوية ثنائية الفصيلة من خلال الميوس إلى ناضجة، الحيوانات المنوية haploid. خلال هذه العملية، يتم تشكيل هيكل الكروماتين النووي للخلايا الجرثومية بشكل مستمر وديناميكي. ينتشر السطح عادة ما تستخدم للفحص الخلوي للخلايا المنوية الفردية. وهناك طريقة سائدة من ينتشر السطح يستخدم العلاج hypotonic التي تنتشر الخلايا المنوية الفردية وسويت1. هذه الشروط هي الأمثل للتحليل التفصيلي للكروموسومات المريوتيكية. الميزات الكروموسومية مثل حالة متشابك و بؤر إعادة التركيب يمكن ملاحظتها بسهولة باستخدام هذه الطريقة. ومع ذلك ، فإن العلاج تحت الحجري يعطل بنية الكروماتين دون النووية ، وبالتالي فإن هذه التقنية ليست مناسبة للتحليل الهيكلي للنوى. وبالتالي، تم تصميم طريقة محسنة للحفاظ على بنية الكروماتين ثلاثية الأبعاد للخلايا الجرثومية الخصية. وقد وصفت هذه الطريقة بأنها طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد (3D)(الشكل 1). وقد مكنت طريقة الشريحة 3D الكشف عن توطين الحمض النووي الريبي الوليدة في النوى لأنه تم الأمثل في البداية لفحص التعبير الجيني وحالات الكروماتين خلال تمايز الخلايا الجرثومية الخصية من قبل RNA مضان في التهجين الموقعي (FISH)2,3. هذه الطريقة ثلاثية الأبعاد تنطبق أيضا على الجمع بين الفلورة المناعية والحمض النووي والأسماك الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، ساعدت هذه الطريقة في اكتشاف كروماتين الجنس بعد ميوتيك (PMSC) ، وهي مقصورة صامتة من الكروموسومات الجنسية الموجودة في الحيوانات المنوية بعد ميوتيك2.
تم تحسين طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد في الأصل من خلال الجمع بين خطوتين أساسيتين لإعداد الشرائح المستخدمة عادة للتلطيخ النووي: خطوة التثبيت المصممة لإصلاح المواد النووية وخطوة الثبات التي تهدف إلى إزالة المواد السيتوبلازمية من أجل تحسين إمكانية الوصول إلى الكواشف التلطيخية ، مثل الأجسام المضادة ومسابير FISH. كما سبق وصفه في منشور آخر 3 ، فقد تقرر أن خطوة permeabilization يجب أن تسبق خطوة التثبيت من أجلالحصولعلى أفضل النتائج مع خلفية السيتوبلازمية منخفضة. في طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد هذه ، يتم تنفيذ خطوة permeabilization وخطوة التثبيت اللاحقة مباشرة على الأنابيب شبهiferous ويتبعها الانفصال الميكانيكي للخلايا الجرثومية مع ملقط قبل السيتوسبينينغ على الشرائح. تم تطوير طريقة بديلة لأسماك الحمض النووي الريبي من الخلايا المنوية في مختبر آخر4. في هذا الأسلوب، بما يتفق مع الأسلوب 3D، يجب أن تسبق خطوة permeabilization خطوة التثبيت من أجل الحصول على أفضل النتائج من RNA FISH.
يصف البروتوكول التالي طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد ويقدم مثالا على تطبيق محتمل، Cot-1 RNA FISH للكشف عن الحمض النووي النووي الريبي الناشئ. يتكون الحمض النووي ل Cot-1 من عناصر متكررة في الجينوم. هنا، يتم تهجين مسبار الحمض النووي Cot-1 إلى intron و UTR من النصوص الوليدة، وبالتالي الكشف عن المناطق النشطة نسخيا في النواة5،6. الشرائح ثلاثية الأبعاد متعددة الاستخدامات ويمكن تطبيقها على مزيج من تقنيات immunofluorescence والحمض النووي وRNA FISH من أجل الحصول على فحص مفصل للعلاقات المكانية بين هندسة الكروماتين.
في إعداد الشرائح ثلاثية الأبعاد، تسبق خطوة permeabilization خطوة التثبيت. يتم تنفيذ هذه الخطوات مباشرة على الأنابيب شبهiferous، وبالتالي الحفاظ على بنية الكروماتين ثلاثي الأبعاد. خيار بديل للحفاظ على بنية الكروماتين لسمك الحمض النووي الريبي / الحمض النووي هو تنفيذ خطوة permeabilization وخطوة التثبيت في وق?…
The authors have nothing to disclose.
أشكر جيني ت. لي على الإشراف على هذا المشروع عندما كنت في مختبر لي وتايلر برويرينغ لتحرير المخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل جائزة الباحث باسل أوكونور كاتب من مسيرة مؤسسة الدايمات ومنحة المعاهد القومية للصحة GM098605.
Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 |
Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit | Agilent |
300380 |
Herring sperm DNA Solution | Invitrogen | 15634-017 |
Ethanol, 200 proof (absolute) | Pharmco-AAPER | 111000200 |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 |
Formamide deionized | American Bioanalytical | AB00600-00500 |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | C8532 |
Bovine serum albumin | Lifeblood Medical | 77110-100 |
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D6001 |
RPMI 1640 | Invitrogen | A10491-01 |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 |
PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M0250 |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 76240 |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 |
VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H1200 |
Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S |
Illustra MicroSpin G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 |
Forceps | VWR | 300-050 |
Microcentrifuge tubes | Bioexpress | C-3262-1 |
Cytospin 3 | Shandon | |
Coplin jar | Fisher | 08-815 |
Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 |
4-well dish | Fisher | 12-566-301 |
Cover glass | Fisher | 12-544-G |
Air incubator | Revolutionary Science | RS-IF-203 |