In vitro Test di cocultura per valutare la migrazione transeteliale neutrofila indotta da agenti patogeni

Summary

La migrazione transeteliale neutrofila in risposta all’infezione batterica della mucosa contribuisce alla lesione epiteliale e alla malattia clinica. È stato sviluppato un modello in vitro che combina agenti patogeni, neutrofili umani e strati cellulari epiteliali umani polarizzati coltivati su filtri transwell per facilitare le indagini verso lo svelamento dei meccanismi molecolari che orchestrano questo fenomeno.

Abstract

Le superfici mucose fungono da barriere protettive contro gli organismi patogeni. Le risposte immunitarie innate vengono attivate al momento del rilevamento dell’agente patogeno che porta all’infiltrazione di tessuti con cellule infiammatorie migratorie, principalmente neutrofili. Questo processo ha il potenziale per essere distruttivo per i tessuti se eccessivo o tenuto in uno stato irrisolto.  I modelli in vitro coculati possono essere utilizzati per studiare i meccanismi molecolari unici coinvolti nella migrazione transeteliale neutrofila indotta da agenti patogeni. Questo tipo di modello offre versatilità nella progettazione sperimentale con l’opportunità di manipolazione controllata dell’agente patogeno, della barriera epiteliale o del neutrofilo. L’infezione patogena della superficie apicale dei monostrati epiteliali polarizzati coltivati su filtri transwell permeabili istiga la migrazione basolaterale ad apicale transeteliale dei neutrofili applicata alla superficie basolaterale. Il modello in vitro descritto nel presente documento dimostra i molteplici passaggi necessari per dimostrare la migrazione neutrofila attraverso un monostrato epiteliale polmonare polarizzato che è stato infettato da P. aeruginosa patogena (PAO1). Viene descritta la semina e la 155azione di transmeabili con cellule epiteliali polmonari derivate dall’uomo, insieme all’isolamento dei neutrofili da tutto il sangue umano e alla ristrutturazione di PAO1 e K12 E. coli nonpathogenico (MC1000).  Il processo di emigrazione e l’analisi quantitativa dei neutrofili migrati con successo che sono stati mobilitati in risposta all’infezione patogena sono mostrati con dati rappresentativi, compresi i controlli positivi e negativi. Questo sistema di modelli in vitro può essere manipolato e applicato ad altre superfici mucose. Le risposte infiammatorie che comportano un’eccessiva infiltrazione di neutrofili possono essere distruttive per ospitare i tessuti e possono verificarsi in assenza di infezioni patogene. Una migliore comprensione dei meccanismi molecolari che promuovono la migrazione transeteliale neutrofila attraverso la manipolazione sperimentale del sistema di saggi di cocultura in vitro descritto nel presente documento ha un potenziale significativo per identificare nuovi obiettivi terapeutici per una serie di malattie infettive e infiammatorie mucose.

Introduction

Le superfici mucose fungono da barriere fisiche e immunologiche che forniscono protezione contro le minacce esterne pervasive^{nell’ambiente 1,2}. Questa barriera epiteliale protettiva può essere compromessa quando gli organismi patogeni invadono². Nel caso di un agente patogeno batterico, questo incontro spesso istiga un processo infiammatorio attivando il sistema immunitario innato e innescando una rapida mobilitazione dei granulociti del primo soccorritore noti come neutrofili^2-4. Gli agenti chemiotattici che facilitano il reclutamento dei neutrofili sono prodotti in parte dalle cellule epiteliali mucose che cercano di liberare l’ospite dall’agente patogeno ofa^{offendente 2-4}. Un’infiltrazione neutrofila eccessiva o irrisolta della superficie epiteliale mucosa può causare una patologia^{significativa 1,5}. Questa è una conseguenza del danno tissutale non specifico causato dall’arsenale neutrofilo antibatterico^5-7. In questi casi, la capacità di clearance batterica dei neutrofili è oscurata dalla distruzione del tessuto ospite durante un insulto infettivo.  L’interruzione della funzione protettiva di barriera epiteliale può portare a una maggiore esposizione del tessuto sottostante a microrganismi e / o tossine, esacerbando ulteriormente la patologia^{della malattia 8,9}. Queste conseguenze possono essere osservate in più sistemi di organi tra cui il polmone e il tratto^{digestivo 1,5}. Inoltre, condizioni infiammatorie non infettive come gravi attacchi di asma, broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) e malattia infiammatoria intestinale (IBD) sono contrassegnate dalla violazione patologica della barriera epiteliale mucosa da un’eccessiva risposta neutrofila^4,5,10-12.

Il complesso processo di reclutamento dei neutrofili a seguito di infezione della mucosa comporta diversi passaggi^{compartimentati 1,5,13,14}. In primo luogo, i neutrofili devono partire dalla circolazione attraverso una serie di interazioni cellula-cellula che facilitano la migrazione trans-endoteliale^1,13. I neutrofili navigano quindi nello spazio interstiziale esistente contenente matrice^{extracellulare 1,14}. Per raggiungere il lume della mucosa infetta, i neutrofili devono quindi migrare attraverso la barriera epiteliale^1,4,5. Questo intricato fenomeno multistep è spesso studiato in aggregato utilizzando modelli animali in vivo di infezione¹⁵. Tali modelli sono utili per stabilire la necessità di fattori specifici, come chemiochine, molecole di adesione o percorsi di segnalazione che partecipano al processo complessivo ma sono in gran parte inadeguati per risolvere i contributi molecolari critici per ogni fase^{compartimentata distinta 16}. I sistemi in vitro coculati che modellano la migrazione trans-endoteliale, trans-matriciale o transepiteliale dei neutrofili sono stati particolarmente utili a^{questo proposito 1,14,16,17}.

È stato sviluppato un solido sistema di dosaggio della cocoltura allo scopo di decifrare i meccanismi responsabili della migrazione transeteliale neutrofila in risposta all’infezione^{patogena 18-22}. Questo modello prevede di infettare la superficie apicale degli strati cellulari epiteliali umani polarizzati con un agente patogeno batterico seguito dall’applicazione di neutrofili umani appena isolati sulla superficie basolaterale^18-22. I neutrofili migrano attraverso la barriera epiteliale in risposta a prodotti chemiotattici derivati epiteliali secreti a seguito di infezione^{patogena 18,21-23}. Questo sistema modello è stato utilizzato utilizzando colture epiteliali intestinali e polmonari esposte a patogeni batterici specifici del tessuto appropriati e ha svelato nuovi meccanismi molecolari probabilmente importanti per il processo di reclutamento dei neutrofili durante l’infezione della^{mucosa 3,8,19,24-28}. La forza di questo modello di cocultura in vitro è che un approccio riduzionista consente allo sperimentatore di manipolare sperimentalmente l’agente patogeno, la barriera epiteliale e / o il neutrofilo in un sistema ben controllato, altamente riproducibile, abbastanza economico. Le informazioni raccolte da questo approccio possono essere efficacemente sfruttate per condurre analisi mirate degli eventi compartimentati durante il reclutamento di neutrofili utilizzando modelli di infezione in vivo ^22,29,30.

Questo articolo illustra i molteplici passaggi necessari per la corretta istituzione di questo modello riproducibile per esplorare la migrazione transeteliale neutrofila indotta da agenti patogeni. Le barriere epiteliali polmonari infettate dall’agente patogeno Pseudomonas aeruginosa sono presenti in questo articolo; tuttavia, altri epiteli tissutali e agenti patogeni possono essere sostituiti con piccole modifiche. La semina e la valutazione di strati di cellule epiteliali polmonari polarizzate su filtri transwell permeabili rivestiti di collagene invertito è dettagliata nel presente documento, così come la crescita della P. aeruginosa patogena e l’isolamento dei neutrofili dal sangue intero. Come questi componenti sono combinati per osservare la migrazione transeteliale neutrofila indotta da agenti patogeni viene presentato insieme ad opportuni controlli positivi e negativi per stabilire un saggio riproducibile. La versatilità di questo approccio per esaminare vari aspetti della migrazione transeteliale neutrofila indotta da agenti patogeni viene discussa con riferimento a studi specifici in letteratura.

Protocol

I passaggi (1-3) devono essere eseguiti in un ambiente sterile sotto una cappa di flusso laminare. 1. Transwell di rivestimento di collagene Fare una soluzione di collagene da 30 μg/ml. Diluire 3 mg/ml di collagene stock 1:100 in 60% di etanolo che è stato passato attraverso un’unità filtrante da 0,2 μm. Soluzione vortici diluita da 30 μg/ml. Nota: Non è necessario vortice la soluzione di stock di collagene da 3 mg / ml, poiché questa soluzione è abbastanz…

Representative Results

Diversi studi hanno dimostrato che gli strati epiteliali infetti da agenti patogeni facilitano la migrazione transetelialeneutrofila 3,8,19,24-28,31,32. Ciò avviene attraverso un’induzione specifica patogena di un gradiente chemiotattico neutrofilo derivato da cellule epiteliali3,23. Ad esempio, la P. aeruginosa patogena che interagisce con la superficie apicale delle cellule epiteliali polmonari fa sì che un numero sostanziale di neutrofili migri attraverso lo strato epiteliale18,22…

Discussion

La migrazione neutrofila attraverso le superfici epiteliali mucose è una caratteristica comune nella patologia della malattia a seguito dell’infezione da agenti patogeni^{batterici 3}. La metodologia descritta nel presente documento offre un approccio rapido e diretto per isolare sperimentalmente questo evento discreto utilizzando un sistema di saggi di cocoltura in vitro derivato da cellule umane che modella una caratteristica del processo infiammatorio innescato da infezioni batteriche. Questo sistema…

Materials

NCl-H292 cells	ATCC	CRL-1848
RPMI-1640 medium	ATCC	30-2001
Pseudomonas aeruginosa PAO1	ATCC	#47085
Escherichia coli MC1000	ATCC	#39531
D-PBS (1x) liquid	Invitrogen	14190-144	without calcium and magnesium
Heat Inactivated Fetal bovine serum	Invitrogen	10082-147	10% added to culture medium
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122	100x: 10,000 units of penicillin and 10,000 µg of streptomycin per ml.
Trypsin-EDTA (0.05%)	Invitrogen	25300-062	50 ml aliquots are stored frozen at -20 ºC.  Aliquot in use can be stored at 4 ºC short-term.
Hank's Balanced Salt Solution – HBSS(-)	Invitrogen	14175-079	Sterile, without calcium and magnesium
Trypan Blue Solution	Invitrogen	15250-061.	Stock = 0.4%
Collagen, Rat Tail	Invitrogen	A10483-01	Can also be isolated in the laboratory directly from the tails of rats using standard protocols
Citric acid	Sigma-Aldrich	C1909-500G	Component of 1 M citrate buffer and acid citrate dextrose (ACD) solution
Sodium Citrate	Sigma-Aldrich	S4641-500G	Component of 1 M citrate buffer
Dextrose anhydrous	Sigma-Aldrich	D8066-250G	Component of acid citrate dextrose (ACD) solution
Ammonium Chloride	Sigma-Aldrich	213330-500G	Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014-500G	Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
EDTA	Sigma-Aldrich	ED-100G	Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
HBSS(+) powder	Sigma-Aldrich	H1387-10L	Key component of HBSS+
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-500G	Component of HBSS+
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-25ML	Follow vendor instructions to coat glass pipette tips
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-9284
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS)	Sigma-Aldrich	A9941-50TAB	Key component of ABTS substrate solution
30% Hydrogen Peroxide Solution	Sigma-Aldrich	H1009-100ML	Component of ABTS substrate solution
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP or fMLF)	Sigma-Aldrich	F-3506	A Stock solution of 10 mM in DMSO should be prepared and aliquots stored at -20 ºC.
Gelatin Type B	Fisher Scientific	M-12026
Pseudomonas isolation agar	Fisher Scientific	DF0927-17-1	Follow manufacturer’s instructions to make PIA plates
Ficoll-Paque PLUS	Fisher Scientific	45-001-749	Optional, can improve neutrophil purity
Name of Material / Equipment	Company	Catalog Number	Comments
24-well migration plate	Corning Incorporated	#3524
24-well wash plate	Falcon	35-1147	Can be reused if soaked in 70% ethanol and washed thoroughly prior to reuse
96-well plate	Fisher Scientific	#12565501
Transwell Permeable Supports	Corning Incorporated	#3415	Polycarbonate; Diameter: 6.5 mm; Growth area: 0.33 cm2; Dish style: 24-well plate; Pore size: 3.0 µm
Petri dish	Falcon	35-1013	Each Petri dish holds 24 inverted 0.33 cm2 Transwells.
500 ml 0.2 μm filter / flask	Fisher Scientific	09-740-25A	To sterilize acid citrate dextrose (ACD) solution
5-3/4 in glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20A	Coat tips with Sigmacote prior to use
Hemostat	Fisher Scientific	13-812-14	Curved, Serrated
Invertoskop Inverted Microscope	Zeiss	#342222
Versa-Max Microplate Reader	Molecular Devices	#432789