Induzione di Invasive Transitional cellulare Bladder Carcinoma in immunitario intatto umani MUC1 topi transgenici: un modello di sviluppo Immunoterapia
Summary
Un N-butil-N-(4-idrossibutil) nitrosamine indotta modello di cancro alla vescica è stato sviluppato in mucina umano 1 (MUC1) topi transgenici per la fine del controllo MUC1-diretto immunoterapia. Dopo la somministrazione di un vaccino peptidico MUC1-mirata, una risposta di linfociti T citotossici per MUC1 è stata confermata misurando i livelli sierici di citochine e l'attività delle cellule T specifiche.
Abstract
Un modello preclinico di carcinoma invasivo della vescica è stata sviluppata in mucina umano 1 (MUC1) transgenici (MUC1.Tg) topi per lo scopo di valutare l'immunoterapia e / o chemioterapia citotossica. Per indurre il cancro della vescica, topi C57BL / 6 (tipo MUC1.Tg e selvatici) sono stati trattati per via orale con il cancerogeno N-butil-N-(4-idrossibutil) nitrosamine (OH-BBN) di 3,0 mg / giorno, 5 giorni / settimana per 12 settimane. Per valutare gli effetti di OH-BBN sul profilo delle citochine nel siero durante lo sviluppo del tumore, il sangue intero è stato raccolto tramite sanguina sottomandibolari prima del trattamento e ogni quattro settimane. Inoltre, un vaccino peptidico MUC1-targeting e placebo sono stati somministrati a gruppi di topi settimanali per otto settimane. Sono state eseguite Multiplex fluorimetrici immunoanalyses microsfere di citochine sieriche durante lo sviluppo del tumore e dopo la vaccinazione. Alla cessazione, interferone gamma (IFN-γ) / interleuchina-4 (IL-4) ELISpot analisi per MUC1 risposta immunitaria delle cellule T specifiche e valutazioni istopatologiche di tipo tumoralee grado sono stati eseguiti. I risultati hanno mostrato che: (1) l'incidenza di cancro alla vescica nei topi di tipo sia MUC1.Tg e selvaggia è stata del 67%, (2) carcinomi a cellule transizionali (TCC), sviluppati in un rapporto di 2:1 rispetto ai carcinomi a cellule squamose (SCC) , (3) citochine infiammatorie aumentate con il tempo durante lo sviluppo del tumore, e (4) la somministrazione del vaccino peptidico induce un profilo di citochina Th1 siero-polarizzata e una specifica risposta di cellule T MUC1. Tutti i tumori nei topi MUC1.Tg sono stati positivi per MUC1 espressione, e la metà di tutti i tumori nei topi di tipo MUC1.Tg e selvatici erano invasive. In conclusione, utilizzando un approccio di squadra attraverso il coordinamento degli sforzi di farmacologi, immunologi, patologi e biologi molecolari, abbiamo sviluppato un modello di topo transgenico intatto immunitario del cancro della vescica che esprime hMUC1.
Introduction
Il carcinoma della vescica è la quarta forma più comune di cancro e l'ottava causa di decessi per cancro negli uomini americani. Negli Stati Uniti, circa 72.500 nuovi casi e 15.000 decessi per cancro della vescica sono attesi tra gli uomini e le donne unite nel 2013 1. L'incidenza del cancro della vescica è di circa tre volte superiore negli uomini rispetto alle donne. Negli Stati Uniti, carcinomi a cellule transizionali (TCC) rappresentano oltre il 90% dei casi, mentre carcinomi a cellule squamose (SCC) hanno una incidenza di meno del 2% 2. Il tasso di sopravvivenza a 5 anni relativo complessivo per papillare TCC è del 91,5% rispetto a solo il 30,9% per SCC 2. Sebbene non invasive TCC papillari rappresentano circa il 75% dei casi al momento della diagnosi, anche con il trattamento di oltre il 50% dei pazienti va incontro a recidiva entro 5 anni, con un massimo di 30% di questi pazienti in progressione di malattia invasiva muscolare 3,4 . Regimi di trattamento tipici per inv non muscolomalattia Asive comprendono la resezione transuretrale (TUR) seguita da chemioterapia endovescicale. Nei pazienti con Ta alto grado o tumori T1, un TUR ripetizione può essere effettuato prima della chemioterapia 3,4. Per quei pazienti con recidive Ta basso grado o Ta alto grado o lesioni T1, TUR seguita da chemioterapia adiuvante o immunoterapia in forma di Bacillus Calmette-Guerin (BCG) può essere utilizzato 3,4. BCG intravescicale ha dimostrato di essere superiore a endovescicale mitomicina C rispetto al tempo alla recidiva 5. Per la malattia invasiva muscolare T2, cistectomia radicale con o senza chemioterapia neoadiuvante è il corso del trattamento raccomandata 3. In pazienti con SCC, cistectomia radicale sembra essere il trattamento più efficace 6. Dati gli alti tassi di recidiva nonostante i migliori trattamenti disponibili, è evidente la necessità di nuove e più efficaci terapie per il cancro della vescica.
Espansione nuove immunoterapie per bladdcancro ER è un possibile approccio che possono tenere la promessa di estendere la sopravvivenza libera da malattia. Storicamente, BCG è stata l'unica immunoterapia efficace per il cancro della vescica. Il suo meccanismo di azione è pensato per coinvolgere l'induzione non specifico di una T-helper 1 (Th1) tipo di risposta immunitaria tramite l'aumento dei livelli di interleuchina-2 (IL-2) e l'interferone gamma (IFN-γ) 4. Cellulare, o immunità Th1, è critica in immunoterapia del cancro come umorale o Th2, immunità è mai stato dimostrato di essere efficace contro i tumori solidi, con l'eccezione di anticorpi diretti contro recettori di fattori di crescita 7. Nel tentativo di migliorare i benefici di BCG in monoterapia, IFN-α 2B/BCG combinazione di immunoterapia è stata valutata in uno studio clinico di fase II con risultati inconcludenti 8. Un approccio alternativo per immunoterapia per il cancro della vescica può essere di indirizzare antigeni tumore-associati (TAA), la cui identificazione ha reso immunoterapia del cancro più specifico 7 </sup>.
Uno di questi è TAA mucina 1 (MUC1), che è una glicoproteina di superficie cellulare sovraespresso in molti cancri delle cellule epiteliali quali vescica, della mammella, del polmone, cancro del pancreas e 9,10. L'espressione e la modifica di MUC1 è anche sostanzialmente modificate durante la carcinogenesi, tali che espone underglycosylation sequenze antigeniche di amminoacidi conosciuti come numero variabile di ripetizioni in tandem (VNTR) sul nucleo peptide. Mentre MUC1 è un self-molecola, queste regioni VNTR immunodominant normalmente non sono esposti a causa della vasta glicosilazione, e così si sono visti dal sistema immunitario come estraneo 11,12. T-linfociti citotossici (CTL) che riconoscono specificamente MUC1 epitopi sono stati isolati dal tumore-drenanti linfonodi di pazienti con carcinoma mammario 13, così come il sangue e midollo osseo di pazienti affetti da mieloma 14,15, rendendo MUC1 un potenziale bersaglio per un risposta immunitaria cellulare. Le VNTRs immunodominanti della underglycosylated forma di MUC1 sono riconosciuti da CTL, causando la distruzione delle cellule tumorali 16-19. Native risposte immunitarie cellulari e / o umorali verso MUC1 cancerose sono, tuttavia, non abbastanza forte per eliminare i tumori. Per aumentare la risposta immunitaria debole già esistente per MUC1, peptidi immunodominanti sintetici possono essere introdotte attraverso la vaccinazione per generare una risposta CTL abbastanza forte per essere di beneficio clinico 18,20. Un MUC1 vaccino liposomiale ha già dimostrato di aumentare la sopravvivenza nei pazienti con tumore del polmone 21,22, generare CTL in grado di uccidere le cellule tumorali MUC1-positivi, e produrre una risposta di citochine Th1-polarizzato 23,24. Con un alto livello di espressione di MUC1 9,11,25, cancro della vescica è un candidato logico per testare MUC1-diretta immunoterapia 26,27. Inoltre, MUC1 ha potenziale come fattore prognostico nel carcinoma della vescica 28, MUC1 espressione in TCC è significativamente associato con la fase e grado, e TCC metastaticoha dimostrato di continuare ad esprimere MUC1 29.
Per valutare l'utilità potenziale di immunoterapia MUC1-diretto nel cancro della vescica, abbiamo sviluppato un MUC1 umana intatta immunitario (hMUC1)-esprimenti transgenico (MUC1.Tg) modello murino di cancro della vescica congenic sul C57BL / 6 di fondo 30. MUC1 umano viene espresso come proteina self sotto il controllo del proprio promotore, risultando in un pattern di espressione tissutale coerente con quella osservata nell'uomo 30,31. I topi sono stati indotti con la vescica cancerogeno noto N-butil-N-(4-idrossibutil) nitrosamine (OH-BBN) 32, e poi i tumori risultanti sono stati valutati per hMUC1 espressione e tipo di tumore e grado. Per valutare l'effetto della sostanza cancerogena sulla Th1/Th2 livelli di citochine durante lo sviluppo del tumore, i campioni di siero sono stati raccolti periodicamente per l'analisi multiplex. I topi sono stati poi trattati con un vaccino peptidico MUC1-mirata, e la citochina siero e risposte immunitarie sono valuta da multiplex fluorometrica immunologico microbead e ELISpot.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'induzione di successo di carcinoma invasivo della vescica a cellule transizionali e squamose nei topi MUC1.Tg umani offre un modello preclinico per lo sviluppo di immunoterapia. Studi immunotherapeutic richiedono l'uso di un modello intatto immunitario spontaneo per valutare la risposta infiammatoria alla progressione tumorale nel tempo, così come la risposta immunitaria a immunoterapia. In un modello di sviluppo del tumore spontaneo, il microambiente tumorale rimane intatto e tumori sviluppano ad un tasso di…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare l'UC Davis Biology Program del mouse per l'allevamento dei topi. Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione da Merck KGaA, Darmstadt, Germania.
Materials
| Reagent | |||
| N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN) | TCI America | B0938 | |
| 20 G Gavage Needles | Popper & Sons, Inc. | 7921 | Stainless steel |
| Peptide Vaccine | N/A | N/A | investigational agent |
| BD Microtainers | BD | 365957 | |
| Tissue Cassettes | Simport | M490-12 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Lysis Buffer | Pierce | 87787 | |
| Halt Protease & Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 78444 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Mouse Cytokine 20plex Kit | Invitrogen | LMC006 | |
| Magnetic Microsphere Beads | Luminex | MC100xx-01 | xx is the bead region |
| Anti-mouse TNF- Capture Antibody | BD Pharmingen | 551225 | |
| Anti-mouse TNF- Detection Antibody | BD Pharmingen | 554415 | |
| Anti-mouse IFN- Capture Antibody | Abcam | ab10742 | |
| Anti-mouse IFN- Detection Antibody | Abcam | ab83136 | |
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Assay Buffer | Millipore | L-MAB | |
| Cytokine Standard | Millipore | MXM8070 | |
| Multi-screen HTS 96well filter plates | Millipore | MSBVN1210 | |
| SA-PE | Invitrogen | SA10044 | |
| 100 m Nylon Tissue Sieves | BD | 352360 | |
| Splenocyte Separation Media | Lonza | 17-829E | |
| TNF- /IL-4 ELISpot plates | R&D Systems | ELD5217 | |
| Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody | Epitomics | 2900-1 | |
| Goat Anti-actin monoclonal antibody | Sigma | A1978 | |
| Anti-rabbit HRP antibody | Promega | W401B | |
| Goat anti-mouse HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-2005 | |
| PVDF membrane | BioRad | 162-0174 | |
| Mini Protean TGX Precast Gels | BioRad | 456-1083 | |
| Muse Count & Viability Kit | Millipore | MCH100104 | |
| MUC1 Antibody | BD Pharmingen | 550486 | IHC antibody |
| Animal Research Peroxidase Kit | Dako | K3954 | IHC staining |
| [header] | |||
| Equipment and Software | |||
| Millipore plate vaccum apparatus | Millipore | MSVMHTS00 | |
| Luminex Lx200 | Millipore / Luminex | 40-013 | Manufactured by Luminex, distributed by Millipore |
| Luminex Xponent Software | Millipore / Luminex | N/A | Version 3.1; included with Luminex Lx200 |
| Milliple Analyst Software | Milliplex / VigeneTech | 40-086 | Version 5.1 |
| Muse Cell Analyzer | Millipore | 0500-3115 | |
| Muse Software | Millipore | N/A | Version 1.1.0.0; included with Analyzer |
| Dissecting Microscope | Unitron | Z730 | |
| Graphpad Prism Software | Graphpad Software Inc. | N/A | Version 5.1 |
| Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus | BioRad | 165-8001 | |
| Trans Blot SD Cell and PowerPac | BioRad | 170-3849 |
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