Summary

في فيفو الميكروسكوب ثنائي الفوتون من النهايات العصبية في الجلد واحدة

Published: August 24, 2014
doi:

Summary

يتم تقديم بروتوكول للتصوير الطولي دينامية وآفة الليزر الانتقائي من النهايات العصبية في الفئران المعدلة وراثيا مراسل.

Abstract

وتشارك النهايات العصبية في الجلد في العمليات الفسيولوجية مثل الاستشعار 1 وكذلك في العمليات المرضية مثل آلام الأعصاب 2. على المواقع قريبة إلى سطح يسهل التصوير المجهري من النهايات العصبية في الجلد الحية الحيوانية سليمة. باستخدام المجهر multiphoton، فمن الممكن الحصول على الصور الجميلة التغلب على مشكلة تشتت الضوء القوي من أنسجة الجلد. مراسل الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن EYFP تحت سيطرة خاصتك-1 المروج في الخلايا العصبية (بما في ذلك محيط الخلايا العصبية الحسية) مناسبة تماما للدراسات طولية من النهايات العصبية الفردية على مدى فترات طويلة من الزمن تصل إلى عدة أشهر أو حتى مدى الحياة. وعلاوة على ذلك، باستخدام نفس يزر الفيمتو ثانية بالنسبة للتصوير، فمن الممكن أن ينتج آفات انتقائية للغاية من الألياف العصبية للدراسات إعادة الهيكلة الألياف العصبية. هنا، نقدم بروتوكول بسيطة وموثوق بها لmultiphoton طولية في الجسم الحي والتصويرالمجهرية القائم على الليزر على الماوس النهايات العصبية الجلد.

Introduction

النهايات العصبية الجلدية تخضع التغيرات الديناميكية في إطار الدول المرضية المختلفة. يمكن أن الألياف العصبية تذهب من خلال عملية انحطاط وتجديد أو إعادة الهيكلة في سياق أمراض مثل اعتلال الأعصاب المحيطية 2 أو مورتون العصب 3. بعد الإصابات، جزءا هاما من النهايات العصبية المحركة في الجلد هو عودة التعصيب من المنطقة المتضررة. ومع ذلك، فإن نهج مشترك للتحقيق في النهايات العصبية هو خارج الحي النسيجية باجتزاء تفتقر إلى المعلومات في الوقت الحقيقي على العمليات الجارية 4. استخدام علامات الفلورسنت المشفرة وراثيا، فمن الممكن لتتبع النهايات العصبية في الجلد من الحيوانات الحية، وبالتالي الحصول على معلومات غنية وبشكل ملحوظ أكثر ملاءمة على التغييرات الهيكلية. التحقيق في النهايات العصبية الجلدية من الممكن استخدام المجهر الفلورسنت التقليدية، ومع ذلك، تناثر الضوء القوي من أنسجة الجلد تقوض بشدة الجودةمن البيانات المستقاة 5. Multiphoton المجهري يسمح اقتناء صور عالية الدقة في الأنسجة نثر بشدة بسبب الجمع غير الخطية للطاقة فوتونات الضوء الإثارة مما أدى إلى انبعاث مضان فقط من النقطة المحورية لهذا الهدف. هذا التأثير يؤدي إلى زيادة قوية في عمق الاختراق وتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء لقياس في أنسجة الجلد 6. باستخدام نفس الليزر والتصوير، وأنه من الممكن لإنتاج تشريح انتقائية من الألياف العصبية 7. في البروتوكول التالي نقدم لك طريقة التصوير الطولي من النهايات العصبية الجلدية في الجسم الحي في الفئران المعدلة وراثيا مراسل جنبا إلى جنب مع انتقائية الآفة باستخدام الليزر المتاحة تجاريا نظام المجهر multiphoton.

Protocol

وقد تمت الموافقة على الإجراءات التي تجرى على الحيوانات من قبل المجلس الوطني تجربة الحيوانية وفنلندا. 1. إعداد الحيوان للتصوير تخدير الماوس بواسطة intraperitional (IP) حقن الكيتامين (0.08 ملغ من وزن الجس…

Representative Results

باستخدام تقنية الموضحة فمن الممكن أن تتبع نفس الألياف بعد الآفة ودراسة تدهور النهايات العصبية التالفة (الشكل 1). الاستحواذ على كومة مع سمك 120-150 ميكرون هو عادة المناسبة للتصوير متكرر خلال عدة أيام وذلك للحفاظ على الألياف كله في مجال الرؤية. <p class="jove_content" style="…

Discussion

في هذا البروتوكول الفيديو نظهر أسلوب غير الغازية طولية التصوير ثنائي الفوتون من النهايات العصبية واحدة.

يتأثر ديناميات innervations الجلد في أمراض مثل الصدفية والاعتلال العصبي المحيطي والإصابات 9. التصوير ثنائي الفوتون…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن أشكر Neurotar المحدودة للمساعدة التقنية، ومؤسسة CIMO وFGSN للحصول على الدعم المالي.

Materials

Round cover glass  Electron Microscopy Science 72296-05 5 mm diameter #1.5 thickness
Eye drops Viscotears Novartis 2mg/g
Superglue Loctite 401 Henkel 135429
Ketaminol Intervet Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gramm of animal weight)
Rompun Bayer Healthcare Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gramm of animal weight)
Working solution is a mixture of Ketamine 10 mg/ml and Xylazine 1.25 mg/ml in PBS
Ethanol 70%
Distilled water or Milli-Q water
Syringes 1ml  BD 300013
30G 1/2" needles BD 304000
Plastic packaging material Could be purchaized from general hardware store
FV-1000MPE microscope Olympus FV-1000MPE Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation
25X XLPlan objective Olympus XLPLN 25XWMP Water imersion objective optimized for multiphoton imaging
Mai-Tai DeepSee laser (2W) SpectraPhysics
Heating pad Supertech TMP-5b Heating pad with a temperature controller
Metal ring fixator Neurotar Ltd.
ImageJ NIH Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/ 
Thy1-YFPH mice strain JaxLab 003782

Referencias

  1. Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
  2. Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
  3. Wu, K. K. Morton’s interdigital neuroma: a clinical review of its etiology, treatment, and results. J. Foot Ankle Surg. 35, 112-119 (1996).
  4. Lauria, G., Lombardi, R. Skin biopsy: a new tool for diagnosing peripheral neuropathy. BMJ. 334, 1159-1162 (2007).
  5. Cheng, C., Guo, G. F., Martinez, J. A., Singh, V., Zochodne, D. W. Dynamic plasticity of axons within a cutaneous milieu. J. Neurosci. 30, 14735-14744 (2010).
  6. Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J Vis Exp. (46), e2062 (2010).
  7. Sacconi, L., O’Connor, R. P., Jasaitis, A., Masi, A., Buffelli, M., Pavone, F. S. In vivo multiphoton nanosurgery of cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
  8. Robinson, L. R. Traumatic injury to peripheral nerves. Muscle Nerve. 23, 863-873 (2000).
  9. Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  10. Marinkovic, P., Reuter, M. S., Brill, M. S., Godinho, L., Kerschensteiner, M., Misgeld, T. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 4296-4301 (2012).
  11. Amit, S., Yaron, A. Novel systems for in vivo monitoring and microenvironmental investigations of diabetic neuropathy in a murine model. J Neural Transm. 119, 1317-1325 (2012).
  12. Yu, H., Fischer, G., Jia, G., Reiser, J., Park, F., Hogan, Q. H. Lentiviral gene transfer into the dorsal root ganglion of adult rats. Mol Pain. 7, 63 (2011).
  13. Yuryev, M., Khiroug, L. Dynamic longitudinal investigation of individual nerve endings in the skin of anesthetized mice using in vivo two-photon microscopy. J Biomed Opt. 17, 046007 (2012).

Play Video

Citar este artículo
Yuryev, M., Molotkov, D. In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin. J. Vis. Exp. (90), e51045, doi:10.3791/51045 (2014).

View Video