Summary
Matningskretsen i Drosophila melanogaster larver serverar en enkel men kraftfull modell som tillåter ändringar i matningshastighet som korreleras med förändringar i stomatogastric neurala kretsar. Denna krets består av centrala serotonerga nervceller som skickar prognoser till munnen krokar samt framtarmen.
Abstract
Den serotonerga matningskretsen i Drosophila melanogaster larverna kan användas för att undersöka neuronala substrat av avgörande betydelse under utvecklingen av kretsen. Använda funktionell utgång hos kretsen, utfodring, förändringar i neuronal arkitektur av stomatogastric systemet kan visualiseras. Ätbeteende kan spelas in genom att observera graden av indragning av munnen krokar, som får innervation från hjärnan. Motoriskt beteende används som en fysiologisk kontroll för utfodring, eftersom larver använda sina munnen krokar för att korsa över en agar-substrat. Förändringar i ätbeteende kan korreleras med den axonal arkitektur neurites innerverar tarmen. Använda immunohistokemi är det möjligt att visualisera och kvantifiera dessa förändringar. Felaktig hantering av larverna under beteende paradigm kan ändra uppgifter som de är mycket känsliga för manipulationer. Korrekt avbildning av neurite arkitektur innervatingtarmen är kritisk för exakt kvantifiering av antalet och storleken på varicosities liksom omfattningen av förgreningsnoder. Analys av de flesta kretsar tillåter endast för visualisering av neurite arkitektur eller beteendeeffekter, men gör denna modell en att korrelera den funktionella utgången på kretsen med de försämringar i neuronal arkitektur.
Introduction
Drosophila är en extremt kraftfull modellsystem för att studera neurala kretsutveckling på grund av snabb generationstid, låg experimentell kostnad, och förmågan att manipulera och kontrollera genetiska och miljömässiga faktorer. Neurogenes, neuronal väg fynd och synaptogenesis är konserverade mellan människor och Drosophila, därför mekanismerna i att skapa, underhålla och modifiera nervbanor bevaras också.
Klassiska signalsubstanser, som serotonin (5-hydroxitryptamin eller 5-HT) kan fungera som tillväxtfaktorer innan den antar sina roller som signalmolekyler i den mogna neurala kretsen 1-3 Tidigare studier har visat att perturbed nivåer av 5-HT under fosterutvecklingen förändrar anslutning av mogna nervceller 4. Andra har visat att ektopisk applicering av 5-HT till odlade Helisoma neuroner trycka neuritutväxt liksom synaptogenesis 5-7. I Drosophila är utvecklingsstörningar 5-HT-nivåer omvänt relaterade till varicosity antal och storlek, såväl som graden av aborization, utmed längden av neuriter utskjutande till framtarmen från CNS 8.
Serotonerg neurotransmission har visats modulera matnings beteenden i olika arter, inklusive Drosophila 8-9. Matningskretsen i Drosophila är en relativt enkel krets som kan användas som en modell för att korrelera funktionsutgång (matning) med förändringar i utvecklingen av axonal prognoser från hjärnan till framtarmen. Schoofs et al. har visat att Drosophila larver utfodring regleras av centrala mönsterritare som påverkar muskulatur 10. Medan den specifika muskel anatomi inte är fullständigt förstådd, har det visats att den antenn nerv, maxillary nerve, och prothoracic tillbehöret nerv är ansvariga för de muskulära mål som är inblandade iätbeteende. De flesta uppgifter som innefattar muskulatur och nerv anatomi ryggradslösa utfodring är begränsad till Calliphora larver.
Den matningshastighet för andra stadiets larver kan bedömas genom indragning av de cephalopharyngeal sclerites (mun krokar), och är reproducerbar och hög genomströmning. De cephalopharyngeal plattorna är innerveras av fibrer från centrala 5-HT-neuron via främre nerven. Den proventriculus eller framtarmen, innerveras av serotonerga fibrer (recurrens nerv) som fasciculate i midgut och är ansvariga för sammandragningar framtarmen (Figur 1) från 11 till 12. Förändringar i axonal förgrening, och antalet och storleken på varicosities längs neurite längd, kan kvantifieras med hjälp av immunhistokemiska tekniker. Manipulera neuronala 5-HT under utveckling, antingen direkt eller indirekt, kan ändra den funktionella produktionen av denna matningskrets, som kan bedömas och korrelerad med förändringar i morphology av neurite arkitektur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Underhåll av Befolknings Burar
- Bibehåll populations burar vid 25 ° C på en 12 h ljus-mörker-cykel. Så länge som styr-och experimentgrupperna är utsatta för samma ljusförhållanden, då kan utföras av denna teknik i en standard laboratoriemiljö.
- Låt honor att lägga ägg över natten på äppeljuice-agarplattor.
- Samla nykläckta larver genom att upprätthålla plattor med nyligen deponerade ägg vid 25 ° C under 24 timmar. Placera en liten klick av jäst i mitten av plattan för att locka kläckta larverna.
- Samla 1 st stadiets larver som har migrerat in i jäst pasta i mitten av äppeljuice plattan. Använd en metall spatel för att överföra den till en färsk äppeljuice platta. Ytterligare jäst pasta kan tillsättas för att se till att det finns tillräckligt med mat tills analyserna utförs. Druvsaft plattor kan också användas i stället äppeljuice plattorna.
- Skaffa sen 2: a-tidig 3: e stadiet larvae genom att låta 1 st instars till åldern för 40-48 timmar. Inom detta område utfodrings priser är konstanta 13. Ålder kan bekräftas genom undersökning av munnen krokar som det finns tydliga förändringar i denna struktur med varje larv molt.
- Sen 2: a-början av 3: e stadiet larver samlas för beteendeanalyser genom att försiktigt och omfattande tvätt äppelsaft plattor med vatten och samla larver på ett nätfilter. Larverna överförs sedan till en agarplatta.
- Alla analyser utförs parallellt med användning av kontroll-och experimentdjur.
2. Behavioral Paradigm - rörelseorgan
- Placera ett 3: e instar larver på en 2% agar substrat i en 100 mm vävnadsodlingsskål och tillåta larven acklimatisera sig under 30 sek. Larver använda sina cephalopharyngeal sclerites (munnen krokar) för att driva deras kroppar över ytan av agar-substrat. Detta görs på en separat platta eftersom jagt är svårare att visualisera kropps sammandragningar i jästlösningen som djuret är nästan samma färg som jästen.
- Observera och registrera varje posteriort anterior rörelse över substratet under en period av 1 min. n = 20 för varje genotyp. Inte mer än 10 djur bör analyseras per platta.
3. Beteende Paradigm - Utfodring
- Att använda trubbiga Inox # 5 pincett, försiktigt föra den 3: e INSTAR larv från rörelse agarplatta till centrum av en agar fylld platta belagd med 5 ml 2% aktivt bagerijäst lösning. Se till att lösningen är homogen eftersom jästen kommer att bosätta sig med tiden. När i jästlösningen, kommer larver i stort sett kvar och foder, vilket underlättar observation av beteendet. Graden av mun krok kontraktioner korrelerar direkt med mängden mat intas 14.
- Tillåt larv acklimatisera sig under 30 sek.
- Observera och registrera antaletmun krok kontraktioner under en period av 1 min. n = 20 för varje genotyp.
4. Larvernas Gut Dissektioner
- Lägg till en 4% EM-grad formaldehydfixeringslösning i 1 x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) och placera det i en 3-brunnars fläck glas.
- Försiktigt dissekera ut vandrade sen 3: e INSTAR larv tarmar i en 3-väl glasskål med hjälp 1x PBS-lösning, att se varje gång som proventriculus lämnas intakt. Med en forcep, håller den bakre änden, och med den andra, hålla munnen krokar. Håll den bakre änden orörliga, försiktigt dra på munnen krokar för att komma åt innanmätet. Ta bort alla tillhörande vävnader (salivkörtlar, hjärna, fet kropp, etc.), sedan överföra varje tarmen till 3-bra maträtt som innehåller formaldehyd fix. Vandrande 3: e instar larver används därför att i detta skede av utvecklingen, larven upphör matning som förberedelse för pupariation och proventriculus rensas av jäst. <li> Inkubera tarmar vid 4 ° C över natten i en ogenomskinlig vävnadsodlingsboxen.
- Innan du tar bort formaldehyd fixeringslösning från brunnarna, ta bort mag caeca och klipp midgut ~ 150 ìm 2 från proventriculus så att prognoserna tydligt kan ses utan hinder.
- Avlägsna formaldehyd fix från brunnarna och ersätt med 1x PBT (1 x PBS, 0,1% proteas-fritt bovint serumalbumin, 0,1% Triton X-100) buffertlösning. Tvätta tarmar 6x 10 min i 1x PBT. Placera vävnadsprov på en mekanisk rotator samtidigt gör tvättar.
- Inkubera i 4 ° C under 1 h i 10 -6 M 5-HT för att öka serotonin-signalering. Tvätta tarmar 6x 10 min i 1x PBT. Tidigare studier har visat att denna koncentration av exogen 5-HT inte påverkar neuronal arkitektur eller åderbråck densitet i immunohistokemiska analyser och helt enkelt förbättrar signal-brusförhållandet 15-16.
- Inkubera vid 4 &# 176, C över natten i anti-serotonin primär antikropp (monoklonal upp i musen eller polyklonala upp i kanin). Tvätta tarmar 6x 10 min i 1x PBT. Placera vävnadsprov på en mekanisk rotator samtidigt gör tvättar.
- Inkubera vid 4 ° C under 90 min i sekundär antikropp (Alexa Fluor 568 get-anti-mus-eller anti-kanin-IgG, 1:400 utspädning). Tvätta tarmar 6x 10 min i 1x PBT. Placera vävnadsprov på en mekanisk rotator samtidigt gör tvättar.
- Inkubera i 4 mM natriumkarbonat i 10 min på en mekanisk rotator, sedan montera på 4% n-propyl gallate/20 mM natriumkarbonat, och vyn i fluorescens. Natriumkarbonat används för att omvandla de prover till bufferten och pH som används i monteringsmedier.
- Ta bilder av immunvävnadsprover vid 400X förstoring för analys.
5. Analys av Neural strömkrets
- Neurite fibrer kvantifierades (antal och storlek på varicositiesoch grad av förgrening) med användning Neuroleucida och Neuroexplorer. Detta kan dock även ske manuellt eller med hjälp av Simple Neurite Tracer (ett gratisprogram som kan laddas ner på nätet).
- Spåra de enskilda fiber prognoser från hjärnan till proventriculus och kvantifiera varicosity nummer, grenar och antalet stora varicosities per längdenhet. De axonal fibrer som skjuter ut från hjärnan buntas in i recurrens nerv och är inte tillgängliga för analys tills de når proventriculus där de separerar och fasciculate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den serotonergiska matarkrets i Drosophila larv kan fungera som en extremt effektiv modell för att observera inverkan av vissa faktorer på nervsystemets utveckling. Genom kvantifiering av matningshastigheten, är det möjligt att koppla axonal arkitektur av matningskretsen med dess funktionella utgång (fig 1). Den rörelseanalys används som en fysiologisk kontroll för indragningar av munnen krokar, eftersom larver använda sina munnen krokar för att driva sig över ytan av agar. Det bör inte finnas någon skillnad i rörelseapparaten svaren mellan kontroll och muterade genotyper om mutationerna påverkar endast matningskretsen 8 (Figur 2A). Om betydande skillnader förekommer, är det möjligt att larver beteende äventyrades av felaktig hantering. Om larverna stopp under analysen för att försöka gräva igenom agar substrat, kan de vara för gammal, och är sannolikt övergår till vandrande instars.Det är också möjligt agar substrat kan vara för hårt, vilket gör det svårt för larv munnen krokar för att fånga den agar substrat, vilket kan åtgärdas genom att väta agarytan.
Denna analys kan användas för att bedöma om Drosophila stammar med neuronala anatomiska defekter påverkar utvecklingen av det serotonerga matningskretsen. Den muterade ellipsoid kropp öppen (ebo 3) har en strukturell defekt i ellipsoiden kroppen av det centrala komplexet. Jämförelse med vildtyp föräldra Canton-S-stammen, CS wu, avslöjar att dessa anatomiska defekter under hjärnans utveckling leder till deprimerade utfodring medan rörelseförmåga är opåverkad (Figur 2B).
De anatomiska defekter i ebo tre mutanter förefaller att ändra utvecklingen av neurit-arkitekturen i tarmen. Figur 3 visar förändringarna i fiberarkitektur i ebo 3 larver jämförelseröd med CS wu, dessa larver visa en ökning av förgrening samt en ökning av antalet av både små och stora varicosities längs neurite längd. Notera grennoder (pilar), varicosities (pilspetsar), och stora varicosities (asterisker). Figur 4 representerar kvantifiering av dessa bilder.
Korrekt kvantifiering av axonal arkitektur kräver att bilderna vara mycket tydlig. Figur 5A representerar en bild lämplig för analys. Bilder av sämre kvalitet kommer att göra det svårt att skilja mellan fibern och varicosities (Figur 5B). När du fotograferar fiberarkitektur, undvika att ta bilder som innehåller Prognoserna vid den främre av proventriculus, eftersom fibrerna är tätt buntade och separera från varandra och kan verka som om de är grenade. Fler bakre fibrer i midgut är mer grenade eftersom de fasciculate när de en re in inom denna vävnad. Kvantifiering av gren och åderbråck nummer och storlek varicosities, kan analyseras manuellt eller via ett program utformat för att studera neurit morfologi, t.ex. Neuroleucida. Så länge proventriculus inte skadas under den immunohistokemiska protokoll, och bilden är i fokus, kommer förberedelserna att vara acceptabel för avbildning och analys. Om fiberarkitektur klart skiljer sig från bakgrunden, och om enskilda varicosities kan identifieras längs neurite längd, är lämplig för analys av preparatet. Dessutom, om enskilda varicosities kan identifieras från resten av fibern, är detta också en annan indikator på en kvalitet bilder för analys. Alla fibrer analyseras med undantag av de som ligger utanför området av fokus (i vissa fall fibrerna kommer kurvan mellan flera plan av fokus).
es/ftp_upload/51062/51062fig1.jpg "width =" 500px "/>
Figur 1. Den larver matningskretsen. Filé en av 3: e instar larver som visar hjärn-och tarmvävnader (A). Gut vävnader dissekeras från 3: e instar larver immunfärgades med en antikropp framtagen mot Drosophila neuronala tryptofanhydroxylas (DTRH, B) eller 5-HT ( C). A, B. E, matstrupe, Mh, munnen krokar, Pr, proventriculus, Br, hjärna (observera mönstret för 5-HT-neuron). Arrowhead betecknar den främre nerven, arrow, det recurrens nerv C.. proventriculus visande axonala fibrer (pilspetsar). Skala bar = 20 nm. Klicka här för att visa en större bild .
<br /> Figur 2. Anatomiska defekter under hjärnans utveckling leder deprimerad ätbeteende. Djuren analyserades för rörelse (A) och utfodring beteenden (B). Locomotion var opåverkad. n = 20 för varje beteendeanalys 2-3 oberoende experiment. **** P <0,0001, oparat t-test. Linjer ovanför grafen visar standardfel av medelvärdet. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Anatomiska defekter under utveckling av CNS resultat i aberration i tarmen fiberarkitektur. Tarmvävnad dissekerades från 3: e instar larver och immunfärgades med anti-5-HT. Pil anger gren nod. Arrowhead betecknar en liten åderbråck. Asterisk denoterar stora åderbråck. Skala bar = 40 nm. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Anatomiska defekter under hjärnans utveckling resulterar i avvikande tarmen fiberarkitektur. Analys av proventricular vävnad från 3: e instar larver dissekeras och inkuberades med anti-5-HT. Neurite förgrening (A), antalet totala varicosities per 0,1 mm neurite längd (B) och flera stora varicosities (> 1 ^ m 2) per 0,1 mm längd (C). CS wu, 20 fibrer från 17 tarmar från två oberoende försök, ebo 3, 20 fibrer från 18 tarmar från 3 oberoende experiment. **** P <0,0001, ** p <0,01, * p <0,05, oparat ttest linjer ovanför grafen visar standardfel av medelvärdet. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 5. Kvaliteten på bilderna är viktigt för korrekt kvantifiering av tarmens fiberarkitektur. Gut vävnader dissekerade från CS wu 3: e stadiet larver och immun med anti-5-HT. (A). Bra bildkvalitet. (B). Dålig bildkvalitet. Skala bar = 40 nm. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Avvikande utveckling av det serotonerga stomatogastric krets, vilket sker under sen embryogenes, kommer att påverka dess mogna funktion. Förändringar i neurite arkitektur innerverar tarmen kan korreleras med den funktionella utmatningen från kretsen, vilken är matningshastigheten (mätt genom mun krok sammandragningar i en jästlösning) (Figur 1). Användningen av UAS-Gal4 tvåparts systemet i Drosophila gör det möjligt att specifikt rikta upp-eller ned-reglerade expressionen av en given-transkript till en specifik vävnad, förändringar i uttrycket av en given protein exakt kan kvantifieras med hänsyn till de lämpliga verktyg. Denna teknik kan användas för att belysa de områden i hjärnan, och även neuronala delmängder som är nödvändiga för utvecklingen av en specifik neural krets.
Den rörelseanalys används för att bekräfta att larverna inte på annat sätt fysiologiskt äventyras, och därför larver med 40 kropps vägg sammandragningar eller mindre shoULD uteslutas från analyser (Figur 2A). Detta kan ske antingen på grund genotypen orsakar fysiska avvikelser, eller på grund av enskilda djur har skadats under hanteringen. Dessutom måste temperaturen i det rum där analysen utförs som skall styras, eftersom kallare eller varmare temperaturer kan påverka dessa data. Det rekommenderas att utföra detta beteende analys mellan 24-26 ° C. De dagar då temperaturen i test rummet är svalare, har ägarn en tendens att stelna, och därför kommer återvätning av agarplatta krävas efter varje lokomotiv analysen är slutförd för att säkerställa ägarn är tillräckligt mjuk. Det är viktigt att hålla agarplatta för transport fuktig (inte blöt) så att larverna att resa över hela ytan och för att hindra dem från att gräva. Svalare temperaturer påverkar också prestanda larverna på agar substrat, som larver tenderar att resa till förmånliga temperatur (24-26 ° C) 17-18. No mer än 10 djur bör analyseras per platta, och kasta alla platta med punktering i agar substrat.
När du utför utfodring analysen, är det viktigt att vara medveten om att jästsuspensionen kommer att bosätta sig med tiden, som virvlar runt i jästen på plattan säkerställer jästen förblir homogen genom hela analysen. Minskad synlighet munnen krokar kan uppstå om jästlösningen blir alltför koncentrerad. Friska larver placerades i jästmedia kontrakt munnen krokar cirka 150 till 170 gånger per minut; reducerad utfodring kan vara så låg som 120, och den övre gränsen är 210.
När du utför den immunhistokemiska protokollet, är det klokt att immunostain både kontroll-och experimentvävnadsprover parallellt för att säkerställa samma kvalitet av vävnadsprover. Immunofluorescens av neurite arkitektur innervating tarmen kan förbättras genom att inkubera vävnadsprover i primär antikropp över natten vid 4 ° C. Inkubationen of antikroppar vid 4 ° C förbättrar signal-brus-förhållande (figur 5). Kvaliteten av bilderna är mycket viktigt, eftersom detta är avgörande för exakt kvantifiering av fiberns arkitektur (fig 3) för att visa förändringar i förgrening och åderbråck antal och storlek (fig 4). Kvaliteten på vävnadsprover kan förstöras om rotatorn används under tvätttider värmer upp när som helst från konstant användning. Medan avbildning vävnadsproverna tänk på att inte lämna prover under mikroskop ljus för länge eftersom detta kommer att minska immunofluorescens av proverna, inte bara den som nu i fokus men omgivande prover också. Analys av fiberarkitektur kan fullgöras enkelt med hjälp av programvara, men ändå kan även ske manuellt. Klassificering av små och stora varicosities avser området för varicosities, varicosities mätning större än 1 ^ m 2 klassificeras som stora varicosities.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för presidentens forskningsfonden från Saint Louis University delas WSN
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eclipse E-800 Microscope | Nikon Instruments | ||
| Neuroleucida | MBF Biosciences | NL-15 | Used to analyze gut fiber architecture, not necessary to have |
| Northern Eclipse | Empix Inc | Imaging software | |
| G-2E/C TRITC EX 528-553 | Nikon Instruments | 96312 | Filter for specific secondary antibody |
| N.A. 0.75; W.D. 0.72 mm; DIC Prism: 40xI, 40x I-C; Spring loaded | Nikon Instruments | MRH00400 | Objective used for imaging |
| Simple Neurite Tracer | NIH Image J | http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer |
References
- Weiss, E., Maness, P., Lauder, J. Why do neurotransmitters act like growth factors? Perspect Dev Neurobiol. 5, 323-335 Forthcoming.
- Herlenius, E., Lagercrantz, H. Neurotransmitters and neuromodulators during early human development. Early Hum. Dev. 65, 21-37 Forthcoming.
- Budnik, V., Wu, C., White, K. Altered branching of serotonin-containing neurons in Drosophila mutants unable to synthesize serotonin and dopamine. J. Neurosci. 9, 2866-2877 (1989).
- Sodhi, M., Sanders-Bush, E.
- Goldberg, J., Kater, S. Expression and function of the neurotransmitter serotonin during development of the Helisoma nervous system. Dev. Biol. 131, 483-495 (1989).
- Goldberg, J. Serotonin regulation of neurite outgrowth in identified neurons from mature and embryonic Helisoma triyolvis. Perspect Dev Neurobiol. 5, 373-387 (1998).
- Haydon, P., McCobb, P., Kater, S. Serotonin selectively inhibits growth cone motility and synaptogenesis of specific identified neurons. Sci. 226, 561-564 (1984).
- Neckameyer, W. S. A trophic role for serotonin in the development of a simple feeding circuit. Dev. Neurosci. 32, 217-237 Forthcoming.
- De Vry, J., Schreiber, R. Effects of selected serotonin 5-HT 1 and 5-HT 2 receptor agonists on feeding behavior: possible mechanisms of action. Neurosci. Biobehav. Rev. 24, 341-353 (2000).
- Schoofs, A., Niederegger, S., van Ooyen, A., Heinzel, H., Spieß, R. The brain can eat: Establishing the existence of a central pattern generator for feeding in third instar larvae of Drosophila virilis and Drosophila melanogaster. J. Insect Physiol. 56, 695-705 (2010).
- Spieß, R., Schoofs, A., Heinzel, H. Anatomy of the stomatogastric nervous system associated with the foregut in Drosophila melanogaster and Calliphora vicin third instar larvae. J. Morphol. 269, 272-282 (2008).
- Neckameyer, W. S., Bhatt, P. Neurotrophic actions of dopamine on the development of a serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster. Biomed Cent NeuroSci. 13, 26 (2012).
- Sewall, D., Burnet, B., Connolly, K. Genetic analysis of larval feeding behavior in Drosophila melanogaste. Genet. Res. 24, 163-173 (1975).
- Joshi, A., Mueller, L. Evolution of higher feeding rate in Drosophila due to density-dependent natural selection. Evolution. 42, 1090-1093 (1988).
- Budnik, V., Wu, C., White, K. Altered branching of serotonin-containing neurons in Drosophila mutants unable to synthesize serotonin and dopamine. J. Neurosci. 9, 2866-2877 (1989).
- Sykes, P., Condron, B. Development and sensitivity to serotonin of Drosophila varicosities in the central nervous system. Dev. Biol. 286, 207-216 (2005).
- Garrity, P. A., Goodman, M. B., Samuel, A. D., Sengupta, P. Running hot and cold: behavioral strategies, neural circuits, and the molecular machinery for thermotaxis inC. elegansand Drosophila. Genes Dev. 24, 2365-2382 (2010).
- McKemy, D. D.
