Imaging celmembraan letsel en Subcellulaire processen die betrokken zijn in reparatie
Summary
Het genezingsproces beschadigde cellen omvat handel specifieke eiwitten en subcellulaire compartimenten aan de plaats van celmembraan schade. Dit protocol beschrijft assays deze processen volgen.
Abstract
Het vermogen van beschadigde cellen te genezen is een fundamenteel cellulair proces, maar cellulaire en moleculaire mechanismen betrokken bij genezing beschadigde cellen worden slecht begrepen. Hier assays zijn beschreven om het vermogen en de kinetiek van genezing van gekweekte cellen na gelokaliseerde schade controleren. Het eerste protocol beschrijft een eindpunt gebaseerde benadering van celmembraan herstel vermogen van honderden cellen tegelijkertijd te beoordelen. Het tweede protocol beschrijft een real-time imaging benadering om de kinetiek van celmembraan reparatie in individuele cellen na gelokaliseerde letsel met een gepulste laser controleren. Als genezing beschadigde cellen betreft handel in specifieke eiwitten en subcellulaire compartimenten om de plaats van het letsel, de derde protocol beschrijft het gebruik van bovenstaande eindpunt gebaseerde benadering van een dergelijke handel event (lysosomale exocytose) in honderden cellen gewond gelijktijdig beoordelen en het laatste protocol beschrijft het gebruik van gepulste laser letsel met TIRF microskopie aan de dynamiek van de individuele subcellulaire compartimenten in beschadigde cellen bij hoge ruimtelijke en temporele resolutie monitoren. Terwijl de protocollen Hier wordt de toepassing van deze benaderingen het verband tussen celmembraan reparatie en lysosomale exocytose in gekweekte spiercellen bestuderen, kunnen ze worden toegepast als zodanig voor andere hechtende gekweekte cellen en subcellulaire compartiment keuze.
Introduction
Celmembraan handhaaft de integriteit van de cellen door een barrière tussen de cellen en de extracellulaire omgeving. Een chemische, elektrische of mechanische stimulus die de normale fysiologische drempel en de aanwezigheid van binnendringende pathogenen dan kan elk letsel aan het celmembraan en leiden tot een latere cellulaire respons op de schade te herstellen. Om deze verwondingen overleven de celmembraan, cellen beschikken over een efficiënt mechanisme voor reparatie. Dit mechanisme is calcium afhankelijk en gaat intracellulair verkeer van eiwitten zoals annexinen en MG53 oa evenals subcellulaire compartimenten zoals endosomen, lysosomen, Golgi afgeleide blaasjes en mitochondriën aan de benadeelde celmembraan 1-7. Toch blijft de gegevens van de sequentie van moleculaire en subcellulaire gebeurtenissen betrokken bij het herstel van beschadigde celmembraan slecht begrepen.
Reparatie reactie cel kan worden gescheiden in het oorly en late reacties. Vroege reacties, die binnen seconden tot minuten tijdschaal, zijn enorm belangrijk bij het bepalen van de aard van de late reacties die leiden tot succesvol herstel van cellen of celdood. Eindpunt assays gebaseerd op bulk biochemische en cellulaire analyse hebben meegewerkt aan de totstandkoming van de betrokkenheid van de moleculaire en cellulaire processen in de reparatie. Maar vanwege de heterogeniteit en de snelheid van cellulaire reparatiereactie, eindpunt assays niet de kinetische en ruimtelijke data van de reeks gebeurtenissen die tot herstelling. Benaderingen die gecontroleerde schade van celmembraan mogelijk en laat de controle celmembraan reparatie en bijbehorende subcellulaire reacties op hoge ruimtelijke en temporele resolutie zijn ideaal voor dergelijke studies. Hier hebben dergelijke benaderingen gepresenteerd. Twee van de protocollen beschreven benaderingen van de real-time kinetiek van celmembraan reparatie en de subcellulaire responsen geassocieerd met het reparatieproces in levende cellen na laser inj bewakenUry. Ter aanvulling op deze live cell imaging gebaseerde testen, hebben eindpunt assays ook beschreven dat een populatie gebaseerd maatregel voorzien in toezicht reparatie van individuele cellen en de bijbehorende subcellulaire reacties. Om hun nut bewijzen deze benaderingen zijn gebruikt om mensenhandel en exocytose van lysosomen bewaken in reactie op celmembraan letsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Celmembraan schade in vivo optreedt als gevolg van een verscheidenheid van fysiologische stressoren verschillende experimentele benaderingen zijn ontwikkeld om deze na te bootsen. Deze omvatten verwonden celmembraan van hechtende cellen door schrapen ze van de schaal of door passage van door een smalle boring spuit 9,10. Naar aanleiding van dergelijke verwondingen de cellen te genezen in suspensie en niet gehouden aan de extracellulaire matrix zoals ze normaal doen in het weefsel. Weer anderen, zoals…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grants AR055686 en AR060836 en postdoctoraal fellowship aan AD door de Franse Vereniging van de Spierdystrofie (AFM). De cellulaire beeldvorming inrichting gebruikt in deze studie wordt ondersteund door National Institutes of Health Grants HD040677.
Materials
| HBSS | Sigma | H1387 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| HEPES | Fisher | BP410 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| FITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1820 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| Glass beads | Sigma | G8772 | |
| TRITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1818 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| PFA 16% | EMS | 15710 | 4% in PBS |
| Hoechst | Invitrogen | H3570 | 1/10 000 in PBS |
| FM dye | Invitrogen | T3163 | 1 µg/µl in CIM or PBS |
| FITC dextran | Sigma | FD40S | 2 mg/ml in growth medium |
| LAMP1 | Santa Cruz | sc-19992 | 1/300 in growth medium |
| Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG | Invitrogen | A21470 | 1/500 in blocking solution |
| Mounting media | Dako | S3023 | |
| Coverslips | Fisher | 12-545-86 | |
| Glass bottom petridish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Silicone O ring | Bellco | 1943-33315 | |
| Coverslip holder | Bellco | 1943-11111 | |
| Invitrogen | A-7816 | ||
| DMEM | VWR | 12001-566 | |
| FBS | VWR | MP1400-500H | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Penicillin/Sreptomycin | VWR | 12001-350 | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Chicken serum | Sigma | C5405 | 5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining |
| PBS (Ca2+ and Mg2+ free) | VWR | 12001-664 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus America, PA | IX81 | |
| TIRF illuminator | Olympus America, PA | Cell^TIRF (IEC60825-1:2007) | |
| Epifluorescence illuminator | Sutter Instruments, Novato CA | Lambda DG-4 (DG-4 30) | |
| CCD Camera | Photometrics, Tucson, AZ | Evolve 512 EMCCD | |
| Image acquisition and anaysis software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Slidebook 5 | |
| Pulsed laser | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Ablate (3iL13) | |
| Stage top incubator | Tokaihit, Japan | INUBG2ASFP-ZILCS |
Referencias
- Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Miyake, K., McNeil, P. L. Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. Blebbing confers resistance against cell lysis. Death Differ. 18, 80-89 .
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling. Cell Biol. 193, 455-464 (2011).
- Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).
- McNeil, P. L., Clarke, M. F., Miyake, K. Cell wound assays. Protoc. Cell Biol. Chapter 12, (2001).
- McNeil, P. L. Direct introduction of molecules into cells. Protoc. Cell Biol. Chapter 20, (2001).
- Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).
- Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. Cell Biol. 168, 429-439 (2005).
- Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy. Cell Biol. 149, 23-32 (2000).
- Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. 388, 474-478 (1997).
- Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).
- Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. Current Protocols in Cell Biology. , 4.12.1-4.12.15 (2003).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).
- Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Imaging single events at the cell membrane. Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).
