Выделение и функциональная характеристика человека желудочка кардиомиоцитов из свежих хирургических образцов

Summary

Современные знания на клеточном основе сердечных заболеваний в основном опирается на исследования на моделях животных. Здесь мы опишем и проверить новый метод для получения одного жизнеспособного кардиомиоциты от небольших хирургических образцах миокарда человека желудочка. Миоциты человека желудочковая могут быть использованы для электрофизиологических исследований и тестирования на наркотики.

Abstract

Кардиомиоциты от больных сердец подвергаются сложных ремоделирования процессов, связанных с изменениями в структуре клеток, сокращение возбуждения муфты и мембраны ионных токов. Эти изменения, вероятно, будут ответственны за увеличение аритмогенного риска и сократительных изменений, ведущих к систолического и диастолического дисфункции у кардиологических больных. Тем не менее, большая часть информации об изменениях функции миоцитов при кардиологических заболеваниях пришел из животных моделей.

Здесь мы опишем и проверить протокол для изоляции жизнеспособных миоцитов от небольших хирургических образцах миокарда желудочков у пациентов, перенесших операции на сердце операции. Протокол описан подробно. Электрофизиологические и внутриклеточных измерений кальция, как сообщается, продемонстрировать возможность ряда измерений одиночных клеток в кардиомиоциты желудочков человека, полученных с помощью этого метода.

Протокол сообщил онповторно может быть полезно для будущих исследований в области клеточной и молекулярной основе функциональных изменений человеческого сердца в присутствии различных сердечных заболеваний. Кроме того, этот метод может быть использован для идентификации новых терапевтических целей на клеточном уровне и для проверки эффективности новых соединений на кардиомиоцитов человека, с прямым поступательного стоимости.

Introduction

Рассечение электрофизиологических свойств миокарда прогрессировала заметно после разработки методов для одной изоляции сердечной миоцитов. Последние достижения в понимании сердечной возбуждения сжимающих Муфта (ИС-связь) также стало возможным благодаря способности изоляции жизнеспособных одиночных кардиомиоцитов, которые сохраняют все физиологические свойства неповрежденной ткани. Регулярно используются методы патч зажим для изучения функции и фармакологической модуляции сердечного сарколемных ионных токов. Записи динамики внутриклеточного кальция с Са ^{2 +} чувствительных красителей также регулярно выступал на отдельных кардиомиоцитов из различных здоровых и больных моделей, предоставляя жизненно важные данные о физиологии EC-муфтой, а также на патологических изменений внутриклеточного Ca ^{2 +} гомеостаз приводит к механической обесценение и повышенной аритмогенного бремени при кардиологических заболеваниях. InformaТион из этих исследований имеет решающее значение для понимания электрофизиологические и механические эффекты препаратов в клинических условиях. Однако есть виды характерные отличия в трансмембранных токов и в белках EC-Голова, на которые приходится особенностей потенциала сердечной действий и сердечных механики. Таким образом, в то время как исследования миоцитов изолированных от не человека млекопитающих выяснена биофизические свойства и физиологические роли конкретных трансмембранных ионных каналов и EC-Голова белков, они не обязательно предоставлять соответствующие модели кардиомиоцитов человека. Выделение жизнеспособных миоцитов из миокарда человека Поэтому крайне важно, чтобы в полной мере понять патофизиологии заболеваний сердца и утвердить новые терапевтические подходы.

Человеком предсердий ткань легко доступна как ушек предсердий часто отбрасывается во время хирургических процедур. Первоначальные количественные исследования взрослого человека потенциалов сердца действий и ионной у.е.rrents занятых ферментативно изолированный: мерцательная ячеек ^1-4. Записи потенциалов действия или токов от отдельных взрослых желудочковой клеток человека были впоследствии сообщил ^3,5-10. Большинство из этих исследований использовали клетки, полученные из эксплантированных сердца и используемые либо коллагеназы перфузии сегмента коронарной артерии или воздействием относительно большого количества вырезанной ткани коллагеназы, чтобы получить изолированных клеток. Эти исследования позволили подробную характеристику ряда трансмембранных ионных токов от желудочковой кардиомиоцитов человека от здоровых сердец и от пациентов с терминальной сердечной недостаточности. Записи L-типа Са ^{2 +} ток (Я _Ca-L) ^5-7, переходный ток наружу калия (я _к) ^8, внутрь выпрямителя тока калия (Я _κ1) ^8, различные компоненты замедленного выпрямителя тока калия (Я _κ ) ⁹ поступало. Авансы и переработкапроцедура изоляции ^10, позволило четко охарактеризовать ионной основе возросшей аритмогенного потенциала в терминальной сердечной недостаточности, содержащей потенциала действия продление ^11, задержка после деполяризаций ¹² и увеличился смешное текущий ¹³ приводит к диастолической деполяризации и экстрасистол.

Взрослые кардиомиоцитов, как правило, изолированы от мелких животных по ретроградной перфузии всем сердцем с различными смесей ферментов, техника, которая производит высокие урожаи Ca ^{2 +-толерантных} клеток ^14. Выделение кардиомиоцитов из фрагментов ткани по своей сути менее успешным, вероятно, из-за ограниченного доступа ферментов в отдельных миоцитов по сравнению с, что достигается за счет перфузии коронарных артерий. Из-за очень ограниченного наличия неиспользованных доноров сердца, единственный практический способ получить нормальные человеческие желудочков клетки на регулярной основе является путем ферментативного digestioн из часто очень небольших фрагментов ткани, вырезанных во время плановых хирургических процедур. Единственная модель болезни человека, который был тщательно характеризуется на клеточном уровне является терминал сердечная недостаточность, из-за доступности пересаженных сердец. Тем не менее, терминал сердечная недостаточность возникает в меньшинстве пациентов и часто включает в себя общий путь тяжелой ремоделирования клеток миокарда, которая является относительно независимым от основной причины ^15. Возможность оценить функцию отдельных кардиомиоцитов из пациентов на более ранней, не сбой стадии заболевания важно понять конкретную патофизиологии различных наследственных или приобретенных условиях. Гипертрофическая кардиомиопатия (HCM) является показательным примером. НСМ является общим (1/500 человек) по наследству сердечной состояние, характеризующееся гипертрофии сердца, повышенное аритмогенных риска и сократительные изменений вследствие обструкции выходного тракта и диастолической дисфункции ^16. Кардиомиоцитов из HCM сердцах уndergo достаточно сложные ремоделирования процессы с участием изменения в структуре клеток (гипертрофия, миофибриллярный беспорядок) и EC-муфта ^17. Тем не менее, большая часть информации из миоцитов дисфункции у HCM пришел из трансгенных животных моделях. Поскольку только меньшинство пациентов HCM развивается в сторону терминальной сердечной недостаточности и требует трансплантации сердца, HCM сердца очень редко доступны для выделения клеток со стандартными методами. Тем не менее, по крайней мере, 30% пациентов HCM развивать симптомы обструкции из-за массивного притока крови гипертрофия перегородки изменяющие выносящего тракта во время систолы (HCM) ^18. Наиболее эффективным доступны терапевтический вариант для облегчения обструкции в HCM является хирургическое перегородки myectomy: во время этой хирургической процедуры, переменная размера часть верхней перегородки удаляют транс аорты подхода. Эта часть гипертрофированной перегородки Поэтому для выделения клеток из свежей ткани.

Способ выделения человеческого ventriculaг миоциты с одного, малых трансвенозной эндомиокардиальной биопсии был ранее разработан и опубликован ^19. Мы реализовали метод, чтобы изолировать одиночные септальные миоциты из образцов миокарда желудочков у пациентов, перенесших операцию на сердце, в том числе пациентов с HCM, проходящих перегородки myectomy и пациентов, перенесших процедуры замены клапана. В дополнение к подробным описанием протокола изоляции, представитель электрофизиологических и Са ^{2 +} флуоресценции измерения представлены, демонстрируя жизнеспособность изолированных желудочковых миоцитов человека и возможности патч зажима и внутриклеточных Са ^{2 +} исследований.

Protocol

Экспериментальные протоколы о человеческой ткани были одобрены этическим комитетом Кареджи University-больницы (2006/0024713; обновляется мая 2009 года). Каждый пациент дали письменное информированное согласие. 1. Решения и Подготовка оборудования Решения, описаны в …

Representative Results

Описанный выше способ был использован для характеристики функциональных нарушений кардиомиоцитов, выделенных из межжелудочковой перегородки пациентов с гипертрофической кардиомиопатией (НСМ), перенесших операции myectomy, по сравнению с не являющихся В противном случае гипертрофическ…

Discussion

Мы описали и утверждена метод, чтобы изолировать жизнеспособные миоциты от хирургических образцах миокарда человека желудочка. Начиная с описанными ранее протоколов, которые были успешно использованы для изолированных клеток от предсердий хирургических образцов, техники, чтобы поз?…

Materials

Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4 * 7H2O)	Sigma-Aldrich	M1880
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Adenosine	Sigma-Aldrich	A9251
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P5958
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Sigma-Aldrich	237205
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate	Sigma-Aldrich	49601
Pyruvic acid	Sigma-Aldrich	107360
3-Hydroxybutyric acid	Sigma-Aldrich	166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP)	Sigma-Aldrich	A8937
Creatine	Sigma-Aldrich	C0780
Succinic Acid	Sigma-Aldrich	S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E0396
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A0281
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V	Sigma-Aldrich	C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115
Calcium chloride 0.1 M solution	Sigma-Aldrich	53704
Potassium methanesulfonate	Sigma-Aldrich	83000
FluoForte Reagent	Enzo Life Sciences	ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X	Life Technologies	P10020
Perfusion Fast-Step System	Warner Instruments	VC-77SP
Amphotericin B solubilized	Sigma-Aldrich	A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp10.0	Molecular Devices
Digestion Device	CUSTOM	CUSTOM	The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Fig 1 C-D and in Fig.7. We can provide further details if requested
Silicone elastomer for the digestion device's brushes	Dow Corning	SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device	Crouzet	Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting	N.A.	N.A.	The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods