Deze methode wordt uitgelegd hoe op te bouwen en exploiteren van een continue 13 C en 15 N isotooplabelen kamer voor uniforme of differentiële plantenweefsel etikettering. Representatieve resultaten van metabole en structurele kenmerken van Andropogon gerardii worden besproken.
Tracing zeldzame stabiele isotopen uit plantaardig materiaal door het ecosysteem biedt de meest gevoelige informatie over het ecosysteem processen; van CO 2 stromen en vorming organische stof in de bodem om kleinschalige stabiele isotoop biomarker sonderen. Koppeling meerdere stabiele isotopen zoals 13C met 15 N, 18 O of 2 H heeft het potentieel om nog meer informatie over complexe stoichiometrische verhoudingen in biochemische transformaties onthullen. Isotoop gemerkte plantmateriaal is gebruikt in diverse onderzoeken van afbraak van afval en de vorming van organisch bodemmateriaal 1-4. Uit deze en andere studies is het echter duidelijk geworden dat de structurele bestanddelen van plantaardige materiaal anders dan metabole bestanddelen (dwz. Uitloogbare laag molecuulgewicht) in termen van microbiële benutting en langdurige koolstofopslag 5-7 gedragen. Het vermogen om structurele en metabolische componenten bestuderenafzonderlijk biedt een krachtige nieuwe tool voor het bevorderen van de voorhoede van het ecosysteem biogeochemische studies. Hier beschrijven we een werkwijze voor 13C es 15N gemerkte plantmateriaal dat ofwel uniform gelabelde gehele plant of verschillend gemerkte structurele en metabolische installatiedelen.
Hier presenteren we de bouw en exploitatie van een continu 13 C en 15 N etikettering kamer die kan worden aangepast aan verschillende onderzoeksprojecten behoeften te voldoen. Gelijkmatig gemerkte plantenmateriaal wordt geproduceerd door continue etikettering van zaailing tot oogst, terwijl differentiële labeling wordt bereikt door het verwijderen van de groeiende planten uit de kamer weken voor de oogst. Representatieve resultaten van de groeiende Andropogon gerardii Kaw aantonen vermogen van het systeem om efficiënt label plantaardig materiaal op de beoogde niveaus. Door deze werkwijze hebben wij plantaardig materiaal geproduceerd met een 4,4 atoom% 13 C en 6,7 atoom% 15 </ Sup> N uniforme planten label, of materiaal dat verschillend wordt gemerkt door tot 1.29 atoom% 13 C en 0,56 atoom% 15 N in de metabole en structurele componenten (warm water extraheerbare en warm water restcomponenten, respectievelijk). Uitdagingen liggen in het handhaven van de juiste temperatuur, luchtvochtigheid, CO 2-concentratie, en het lichtniveau in een luchtdichte 13 C-CO 2 atmosfeer voor een succesvolle teelt van gewassen. Deze kamer beschrijving vormt een nuttige research tool om effectief te produceren uniform of verschillend multi-isotoop gemerkte plantaardig materiaal voor gebruik in proeven op ecosysteem biogeochemische cycli.
Inzicht in de dynamiek van plant-bodem-atmosfeer processen is van cruciaal belang voor het nauwkeurig voorspellen hoe de globale koolstof (C) en stikstof (N) cycli functie onder de huidige en toekomstige milieu-omstandigheden. Stabiele isotopen zijn krachtige hulpmiddelen in kwantitatieve studies van plant-bodem-atmosfeer C en N fietsen. Tracing zeldzame stabiele isotopen uit plantaardig materiaal door het ecosysteem levert gevoelige informatie in studies van biogeochemische cycli, van CO 2 stromen en bodemvorming organisch materiaal om kleinschalige stabiele isotopen-biomarker indringende bv. 4,8,9. De combinatie van 13C labeling met 15 N etikettering, of andere stabiele isotopen zoals 2 H of 18 O in plantenweefsel biedt een high-detectie, traceerbaar, maar complexe substraat voor gebruik in gekoppelde studies van planten en de bodem biochemie. De mogelijkheid om uniform of differentieel labelen structurele en metabolische plantmateriaal advertentieds verdere vermogen om complexe vragen over C en N fietsen door ecosystemen te pakken. Het voordeel van isotoop gemerkte plantenmateriaal kwantitatieve studies van C en N boekhouding, echter afhankelijk van het vermogen 13C es 15N gelabeld materiaal dat ofwel uniform of verschillend gemerkte produceren.
Isotooplabelen is gebruikt in studies over planten C en N assimilatie 10, allocatie 11 en rhizodeposition 12. Gelijkmatig 13C es 15N gelabelde plantaardig materiaal zorgt voor een complexe gemerkt substraat voor studies van strooiselafbraak 1,4, vorming organische stof in de bodem 2,6, bodem CO 2-uitstoot 4, bodemvoedselweb bestudeert 13, en studies van de bodem C verblijftijden 2,14. Studies met behulp van 13 C-gelabeld biochar van gelabelde plantmateriaal beginnen ook nieuwe informatie over vroeger over het hoofd gezien te onthullenbodem char zwembaden 15. Terwijl 15 N, 2 H en 18 O etikettering zijn relatief gemakkelijk door water en kunstmest behandeling te bereiken, de uitdaging bestaat in het produceren uniform 13C gelabelde plantaardig materiaal tot en met 13 C-CO 2 fixatie.
Continu isotooplabelen van zaailing tot volwassenheid in een afgesloten kamer produceert uniforme isotooplabelen de gehele plant. Andere methoden zoals herhaalde puls labeling 16 en bladtoepassing of wicking 17,18 produceren niet uniform isotoop gemerkte plantmateriaal, noch duidelijke verschil etikettering van specifieke C-verbindingen (bv. metabolische versus structureel) 19. Een belangrijke overweging bij isotopen wordt labelingsefficiëntie, vanwege de hoge kosten van zeldzame isotoop verrijkte verbindingen die voor levensmiddelen. Hoewel continue 13C etikettering in het verleden 2-4,20, er geen kenniseen gepubliceerde gedetailleerde technische beschrijving van een continue labeling kamer met tekenen van hoge labelingsefficiëntie en nauwkeurige controle van de hoeveelheid en uniformiteit van isotopen.
Op de voorgrond van de afbraak van afval en bodemvorming organische stof onderzoek is het concept dat metabole plantaardig materiaal (dwz uitloogbare, labiele, verbindingen met laag molecuulgewicht) en structurele plantmateriaal (dwz. Lignine, cellulose, hemicellulose) verschillend in termen van microbiële verwerkt efficiëntie bij het eindgebruik, vorming organische stof in de bodem, en de lange termijn bodem C opslag 5-7. Plantmateriaal dat differentieel is geëtiketteerd zijn structurele en metabolische componenten, dus een nuttig instrument in het bevorderen afbraak van afval en bodemvorming organisch materiaal onderzoek. Differentiële labeling met dual isotopen maakt voor de opsporing van structurele en metabole componenten afzonderlijk via het ecosysteem via een verdeelstekker zwembad isotoop technique 21.
Continu isotoop labeling met 13 C en andere isotopen in een afgesloten kamer vereist een zorgvuldige aandacht voor fysiologische omstandigheden planten om productiviteit van de vegetatie en isotooplabelen efficiëntie te maximaliseren. Dagtemperatuur spikes moeten worden gecontroleerd om te planten schade bij het kweken in een luchtdichte kamer te voorkomen. Een optimaal bereik van vochtigheid en temperatuur moeten openblijven planten huidmondjes en de CO 2-opname 22 te handhaven. Hoge luchtvochtigheid oorzaak beslaan van de wanden, die de beschikbaarheid van licht minimaliseert en kan de kamer structuur beschadigen. Zorgvuldige afweging om labelingsefficiëntie isotoop door het elimineren van natuurlijke overvloed isotopen uit de kamer (bijvoorbeeld afkomstig uit het oppotten met bodem organische stof) en het voorkomen van blootstelling aan de buitenlucht is van belang bij het werken met dure zwaar isotoop gemerkte verbindingen.
Hier presenteren we een methode voor het bouwen en exploiteren van eencontinue dubbele 13C es 15N isotopen kamer voor de productie van plantaardige materiaal dat ofwel uniform gemerkt of heeft een structurele en metabolische componenten gelabeld op verschillende niveaus. is 13 C etiket gecontroleerd op de kamer niveau, terwijl bemesting en 15 N etikettering gecontroleerd op de individuele pot niveau. Representatieve resultaten zijn het vermogen van deze methode om de temperatuur, vochtigheid en CO2-concentratie gedurende het groeiseizoen controle tonen. Resultaten van groeiende Andropogon gerardii, Kaw ook het vermogen van deze methode om uniform of verschillend gemerkte plantmateriaal te produceren tonen. De beschreven specifieke kamer-ontwerp en werking regeling kan worden aangepast aan verschillende plantensoorten groeien, evenals 2 18 H of O etikettering tegemoet.
Dit ontwerp voor een continue isotooplabelen kamer werd gebruikt om uniform en differentieel produceren 13C es 15N gelabelde A. gerardii voor volgende veld en laboratoriumexperimenten. Gedurende drie groeiseizoenen van de werking, heeft de kamer met succes gehandhaafd temperatuur, vochtigheid en CO 2-concentraties binnen de ingestelde parameters (figuur 2). De betrouwbaarheid van de temperatuurregeling is cruciaal tijdens de piek van de zomer, wanneer hoge zonnestraling oververhitting in de luchtdichte kamer kan veroorzaken. Het wegwerken van overtollig vocht veroorzaakt door transpiratie van de groeiende planten zorgt ervoor dat planten huidmondjes open blijven voor fotosynthetische opname 22 en dat condensatie van water niet lichtinval belemmeren of schade aan de structuur van de kamer.
De bijna continue bewaking van de CO 2-concentratie door de irgA software continu onderhouden13 C etikettering van de planten, terwijl ze in de kamer groeiden. Door de hoge fotosynthetische activiteit van A. gerardii groeien in deze kamer, CO 2 werd geïnjecteerd in het systeem vaak overdag van de piek groeiseizoen wanneer fotosynthetische activiteit trok CO 2-concentraties beneden tot 360 ppm, ongeveer elke 15-20 minuten. De dosering van het verrijkte natuurlijke abundantie 13 C-CO 2 tanks toegestaan voor een gecontroleerde 4,4 atoom% C 13 atmosfeer door het groeiseizoen uniforme plantenweefsel etikettering. 13C-CO 2 productie kan ook worden bereikt door het mengen van 13 C-natrium bicarbonaat of 13 C-natriumcarbonaat en zoutzuur, maar dit type systeem is ingewikkelder en vereist meer controle en onderhoud, dus we raden het gebruik van 13 C-CO 2 gas. Een belangrijke overweging voor de bewaking van de CO 2-concentrations met behulp van een Irga is dat infrarood analyzers verliest tweederde van hun gevoeligheid bij het meten van 13 C-CO 2. Deze onderschatting van ongeveer 2,9% ppm voor onze 4.4% 13 C-CO 2 mengsel was niet van groot belang voor ons, maar kon een kwestie aan belang toenemen bij het benoemen op hogere 13 C niveau 27.
A. gerardii is een warme seizoen eeuwigdurende tallgrassprairie graminoid soorten. Het ontwerp van deze kamer werd geoptimaliseerd voor A. gerardii productie (figuur 1). De grootte en hoogte van de kamer werden gekozen als tegenprestatie voor de maximale hoogte productiviteit van A. gerardii in het veld, evenals voor de gewenste plantaardige biomassa voor toekomstige experimenten. A. gerardii is bekend dat licht in het veld 24,25 beperkt zijn. PAR binnen een kas kan worden verminderd door 30-47% ten opzichte van de buitenkant niveau 26. Aangezien onze fabrieks werden gekweekt in een acryl glazen kamer binnen een serre, PAR beperking was een punt van zorg. Wanneer deze is ingeschakeld, de tl-verlichting vergroot PAR binnen de kamer met 9,5%, die kan hebben bijgedragen aan de productiviteit in dit licht gevoelige soorten te verhogen. Bij gebruik van deze kamer ontwerp op andere soorten planten specifieke fysiologische behoeften zoals grootte, verlichting, voedingsbehoefte, temperatuurgevoeligheid en bodemvocht groeien moeten zorgvuldig worden aangepast om optimale groeiomstandigheden voor de planten te handhaven.
Bij het werken met dure isotopisch gemerkte verbindingen, zoals 10 atoom% 13 C-CO 2 en 98 atoom% 15 N-KNO3, efficiëntie van etikettering een belangrijke overweging. Deze kamer-ontwerp optimaliseert 13C labeling door alle inspanningen om de kamer te verzegelen en het minimaliseren van luchtlekken in en uit de kamer. Als deze kamer nooit tijdens het groeiseizoen wordt geopend, is geen van de 13 C-labeled CO 2 uit de kamer is uitgelekt aan de atmosfeer. De CO 2 op te bouwen tijdens nachtelijke ademhaling niet verschijnt op de groeiende planten beschadigen en wordt snel na zonsopgang (figuur 2) genomen. Tijdens differentiële labeling, werd de kamer kort geopend om de verschillend gemerkte potten te verwijderen, maar dit bleek niet de beoogde 4,4% op atomaire 13 C etikettering van de continu gelabelde planten (tabel 1) te verdunnen. 13C labeling werd ook geoptimaliseerd door schrobben uit de initiële atmosferische lucht in de kamer bij het afdichten. Tijdens voorproeven op de kamer zonder een eerste scrub van de atmosferische CO 2 werden planten gemeten om een verdunde 13 C-niveau in de eerste bladeren geproduceerd dan in de latere bladeren geproduceerd hebben. De eerste scrub van de atmosferische CO 2 na sluiting kamer lijkt dit probleem te elimineren door en maakt de continue 13 C-etikettering vanzaadje tot volwassenheid. Het handhaven van een bodem vrij potgrond mengsel van zand, vermiculiet, en klei elimineert ook natuurlijke overvloed CO 2 vervuiling uit de bodem ademhaling. De eliminatie van de bodem van het systeem vereist een zorgvuldige bemesting en inenting overwegingen, die uniek zijn voor verschillende plantensoorten kunnen zijn. 15 N etikettering door de beoogde 7 atoom% 15 N Hoegland's oplossing geproduceerd zeer gelabeld plantmateriaal op 6,7% op atomaire 15 N (Tabel 1). Een lichte verdunning van de beoogde 15 N merker kan worden veroorzaakt door een natuurlijke overvloed N in de potgrond of de geboortegrond inoculatie.
Tijdens biosynthese van verbindingen, natuurlijke discriminatie 13 C (of 15 N) optreedt als gevolg van kinetische fractionering en nonstatistical isotoop verdeling in de gesynthetiseerde verbindingen. Dus in het geval van C, secundaire producten (bijvoorbeeld lipiden, Fenolverbindingen) algemeen waaruit 13C vergeleken met primaire producten (koolhydraten). Deze natuurlijke discriminatie 13 C blijkt ook blijven bestaan wanneer planten worden gekweekt in een 13 C verrijkte atmosfeer, zoals blijkt uit het geringe verschil in atoom% 13 C van het heetwaterextracten en warm water resten van het uniform gelabelde planten (Tabel 1 ). Deze natuurlijke kinetische fractionering is zeer klein in vergelijking met de verrijking en heeft de uniformiteit van de etikettering niet in gevaar brengen.
Differentiële etikettering van structurele en metabole plantenweefsel is een nieuwe techniek met potentieel voor hogere studies in afbraak van afval, microbiële ecologie en vorming aan organisch bodemmateriaal. Het verschil in 13 C en 15 N van het warm water extracten en warm water residuen wijst op een aanzienlijke verwatering van 13 C en 15 N in de uitloogbare, lagemolecuulgewicht (warm water uittreksels) van de structurele plantmateriaal (warm water residuen) na 7, 14, en 22 dagen van differentiële labeling (P <0,005). Dit verschil etikettering van plantaardige weefsels kunnen worden gebruikt om het lot van structurele en metabole componenten afzonderlijk bijhouden via een ecosysteem. De 13 C differentiële labeling was extremer dan 15 N differentiële labeling. Dit kan te wijten aan de nabijheid van 13C verdunning wanneer het verwijderen van de planten uit de 13 C-gelabeld CO 2 atmosfeer, terwijl de 15 N etiket blijft in de potgrond enige tijd 15 N verdunning optreedt langzamer. Voor meer drastische differentiële labeling van 15 N, kan men overwegen het spoelen van de potten met water voorafgaand aan de natuurlijke overvloed bemesting tijdens de laatste weken van de groei buiten de kamer.
De opzet en werking van deze continue 13 </ Sup> C en 15 N systeem voor de etikettering uniform of differentiële, metabole en structurele, plantenweefsel etikettering voorziet in een nieuwe werkwijze voor het produceren isotoopgelabelde plantmateriaal voor geavanceerd onderzoek. Het ontwerp en de operationele details van deze kamer is gekozen voor 4,4 atoom% 13 C en 7 atoom% 15 N etikettering van A. gerardii, maar kan worden aangepast aan andere vaste isotopen niveaus. De hier beschreven groeiomstandigheden moet worden afgestemd op de grootte, temperatuur, vochtigheid, licht, water en voedingsstoffen eisen van de bijzondere plantensoorten van interesse. Labeling met 18 O of 2 H kan ook worden bereikt door het merken van het water van het irrigatiesysteem. Het hier beschreven systeem behandelt veel van de uitdagingen van een uniforme en differentiële 13C etikettering van plantaardig materiaal. Deze fundamentele kamer-ontwerp kan worden gebruikt door andere onderzoeksgroepen tot zeer gelabeld plantmateriaal voor adv producerenwichtige studies in ecosysteem biogeochemie.
The authors have nothing to disclose.
Speciale dank aan de Plant Groeifaciliteit en EcoCore analytische faciliteit in Colorado State University en de vele studenten en docenten die aan dit project geholpen. Dit werk wordt gefinancierd door de NSF DEB subsidie # 0918482, USDA National Needs Fellowship, en de Cotrufo-Hoppess fonds voor bodemecologie onderzoek.
40 in Remote Tower Fan | Living Accents | FS10-S3R-A | |
42 in Electric Tower Fan with remote control | LASKO | 2559 | |
Mr. Slim Split-type air conditioner | Mitsubishi Electric | R410A | |
Electronic 24 hr time switches | Intermatic | ET100C | Operates Fluorescent Light System |
iSeries Humidity and Temp Controller | Omega | CHiTH-i8DV33-5-El | |
Solid State Relay | Omega | SSRL240 | |
CKR Series Solid State Relay | Crydon | ||
Solenoid Coils | Dayton | 6X543 | |
GasHound CO2 Analyzer | LI-COR | LI-800 | |
Dehumidifier | Dayton | 1DGX4 | |
Specialty gas regulator | Airgas | CGA 580 | |
T5 Hight Output Commercial Fluorescent Light System | Hydro Farm | FLT48 | |
Air pump | Thermo Scientific | 420-1901 | |
Masterflex Cartridge Pump HeadSystem | Cole Parmer | 7553-70 | |
1900 Series Network Switch | Catalyst | ||
Profile Porus Ceramic Top Dressing | Greens Grade | ||
Industrial Quartz 40 mesh | Unimin | 4095 | |
Mycorrhizae Professional Growing Medium | ProMix | ||
Vermiculite and Perlite | Thermo-Ran | C633 | |
Potassium Nitrate- 15N 98 atom % | Sigma-Aldrich | 335134 | |
Carbon-13C Dioxide 10 atom % | Sigma-Aldrich | 600180 | |
Medical grade CO2 | Airgas | ||
Regulator | Airgas | CGA 350 | |
4 in box fans | Grainger | ||
Masterflex PharMed BPT Tubing | Cole Parmer | HV-06508-24 |