Die Entwicklung von Zebrafisch kann über Tage mit Licht-Mikroskopie Blatt, wenn Embryonen werden in optisch klare Polymerrohren mit niedriger Konzentration Agarose eingebettet folgen.
Lichtbogen-Mikroskopie ist das ideale bildgebendes Verfahren zur Zebrafisch embryonalen Entwicklung zu studieren. Aufgrund des geringen Phototoxizität und Bleichen, ist es besonders für die Langzeit Zeitraffer-Bildgebung über mehrere Stunden bis zu mehreren Tagen geeignet. Es wird jedoch ein entsprechender Proben Montage Strategie benötigt, die sowohl Haft und normale Entwicklung der Probe bietet. Multilayer-Montage ist eine neue Einbettungstechnik mit niedriger Konzentration Agarose in optisch klaren Rohre, überwindet nun diese Einschränkung und entfesselt das volle Potential der Lichtmikroskopie Blatt für Echtzeit-Entwicklungsbiologie.
Um die komplexen Ereignisse und Interaktionen während der Embryogenese zu verstehen, ist die Forschung in der Entwicklungsbiologie mehr und mehr Bewegung von Mikroskopie von einzelnen Zellen und Organe in vivo Bildgebung von ganzen Organismen. Traditionelle Mikroskopie-Techniken in der Regel nicht die räumliche und zeitliche Auflösung, um eine schnelle Ereignisse über einen längeren Zeitraum verfolgen und bieten oft dazu führen, Bleichen oder phototoxische Effekte in der Probe ein. Wir und andere gefunden, Lichtbogen-Mikroskopie (Abbildung 1), um die ideale Technik für die in-vivo-Bildgebung der Zebrafisch-4.2 sein. Die Beleuchtung der Probe mit einer dünnen Schicht von Laserlicht, die orthogonal zur Erkennung Achse, bietet eine schnelle optische Schnitte mit hoher räumlicher Auflösung sowie Foto-Toxizität minimiert 5. Zugleich wird durch diese einzigartige optische Anordnung herkömmlichen Probenbefestigungstechniken unter Verwendung von Petrischalen oder Kulturkammern sind nicht geeignet. In einer typischen LichtBlatt Mikroskop drei translatorischen Motoren und Motordreh Halten der Probe, so dass sie präzise positioniert werden kann, gedreht und aus einer beliebigen Richtung betrachtet wird. In den letzten Proben für die Lichtmikroskopie Blatt oft in 2.1% Agarose in einer Glaskapillare 6,7 eingebettet. In diesem Fall wird die erstarrte Agarose Zylinder mit der eingebetteten Probe wird aus der Glaskapillare in die Probenkammer mit wasserartigen Mediums zur Bildgebung gefüllt extrudiert. Agarose hat einen Brechungsindex nahe Wasser und ist daher für die in vivo Mikroskopie Lichtblatt, die Wasser-korrigierten Belichtungs-und Detektionsoptik erleichtert geeignet. Die Probe wird in der starren Agarose beschränkt und kann auch für eine kurze Zeit abgebildet werden, aber morphogenetische Veränderungen und Wachstum des Embryos stark beeinträchtigt, wenn die Abbildung für mehrere Stunden 7,8. Obwohl Lösungen für andere Anwendungen entwickelt worden, 9, die nicht-invasive Langzeit Zeitraffer-Zebrafisch Bildpotential der Lichtmikroskopie Blatt kann mit dem herkömmlichen 1,5% Agarose-Einbettung nicht ausgenutzt werden.
Wir haben deshalb eine neue Strategie für die Montage in vivo Mikroskopie Lichtblatt der Zebrafisch-Embryonen 10. Die Probe wird in 0,1% Agarose mit 200 mg / L Tricaine in einem Rohr des optisch klare Polymer fluorierten Ethylen-Propylen-(FEP) montiert. Der eingebettete Embryo entwickelt normalerweise aufgrund der niedrigen Viskosität des Mediums. Zur gleichen Zeit, beschränkt die FEP-Röhre des Mediums und der Probe für die Dauer des Experiments. Hier bieten wir ein ausführliches Protokoll der neuen Montagetechnik und Darstellung von Daten reflektieren ihre Vorteile gegenüber dem herkömmlichen Protokoll. Wir zeigen, dass unsere Verfahren Zebrabärblingentwicklung kontinuierlich mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung über einen Zeitraum von mehr als zwei Tage abgebildet werden.
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Abbildung 1. Das Prinzip der Lichtbogen-Mikroskopie. Ein Zebrafisch in einem Rohr von fluorierten Ethylen-Propylen (FEP) vorgenommen montiert übersetzt werden kann und durch die Brennebene des Detektionsobjektiv gedreht. Eine dünne Schicht von Laserlicht (Lichtbogen) wird durch die Beleuchtung Ziel in die Fokusebene des Detektionsobjektiv projiziert und beleuchtet nur eine dünne optische Schnitt der Probe. Das emittierte Fluoreszenzsignal wird von der Detektionsobjektiv gesammelt und auf einem Kamera-Chip aufgezeichnet.
Erweiterte Mikroskopietechniken wie Lichtblatt Mikroskopie ermöglichen heute Bilddaten mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung im Laufe von mehreren Tagen aufnehmen, aber auch verlangen Probe Montagetechniken zu verbessern. Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll von Mehrschicht Halterung für Lichtmikroskopie Blatt der Zebrafisch-Entwicklung. Das Verfahren ist einfach zu implementieren und wir sie verwenden in unserem Labor auf einer täglichen Basis.
Die FEP-Schläuche
Schlüsselkomponenten unserer Strategie sind Röhren Montage der Polymer Fluorierte Ethylen-Propylen (FEP) vorgenommen. Wir entschieden uns, FEP vor allem wegen seiner Brechungsindex von 1.338, die ähnlich wie Wasser und daher ideal für die Lichtmikroskopie Blatt mit Wasser-Tauchziele und Probe erfordern wässrigen Medien geeignet ist, zu verwenden. Die Röhrchen mit 0,8 mm Innendurchmesser und 0,4 mm Wandstärke passen die Zebrafisch-Entwicklung sehr gut, kann mit typischen Probenhalter für 1,6 mm geeignet verwendet werdenKapillaren und sind unsere erste Wahl für die Montage vorgestellt Methode. Wir testeten sie gründlich in unserem selbstgebauten Setups sowie im Handelssystem "Lichtschicht Z.1" von Carl Zeiss Mikroskopie und festgestellt, dass FEP Rohre bieten langfristige Stabilität, haben nur minimale Auswirkungen auf die optische Leistung und sind nicht fluoreszierenden 10. Sie sind jedoch nicht für Anwendungen mit Proben, die einen unterschiedlichen Brechungsindex, z. B. gelöscht Probe erfordern.
Rohre und Folien aus FEP sind in einer Vielzahl von Durchmessern und Dicken erhältlich. Darüber hinaus können FEP bei 260 ° C aufgeschmolzen werden und bietet praktisch unbegrenzte Möglichkeiten für maßgeschneiderte Probe Halterungen so. Die Polymerrohre sind in der Regel nicht steril geliefert werden, weshalb das Reinigungsprotokoll umfasst mehrere Schritte, um beste optische Qualität sicherzustellen. Die Beschichtung mit Methylcellulose sichergestellt, daß kein Teil der wachsenden Zebrafischembryo klebt auf das Polymer.
<p class = "jove_step"> Die MontagemediumDie Entscheidung für 0,1% Agarose basiert auf umfangreichen Tests der Wachstumsrate und Unbeweglichkeit in verschiedenen Konzentrationen von Agarose und Methylcellulose 10 basiert. Agarose-Konzentrationen über 0,1% zeigten bereits einen starken Einfluss auf die Wachstumsrate von 24 hpf Zebrafisch. Zusätzlich verwenden wir niedrige Dosen der betäubende Droge Tricaine. Tricaine Blöcke Aktionspotentiale, hemmt dadurch die Signalübertragung zwischen Gehirn und Muskeln und Muskelkontraktionen 16 unterdrückt. Eine Konzentration von 133 bis 200 mg / l gewährleistet eine ausreichende Immobilisierung von Zebrafisch zwischen 24-72 hpf. Allerdings Tricaine und andere Medikamente, die wir getestet Anästhesie zeigen dosisabhängige Nebenwirkungen wie Herz Ödeme. Zusätzlich wird die erforderliche Dosis von Tricaine variiert mit dem Entwicklungsstadium des Embryos. Wir empfehlen daher die Verringerung der Tricaine Konzentration auf die für die Entwicklungsstufen, die abgebildet werden, benötigten Menge. Um beste Performan gewährleistence und verhindern die Bildung von toxischen Nebenprodukten sollte frisch zubereitet oder aufgetaut Tricaine Stammlösung verwendet werden, vor Licht geschützt und nicht über 30 ° C erhitzt
Die Einbettung in FEP Rohre ermöglicht auch eine einfache Änderung der Montagemedium für die spezifischen Bedürfnisse zu berücksichtigen. Für Zeitraffer-Bildgebung des Herzens, empfehlen wir die Verwendung von 3% Methylcellulose und 100 mg / L Tricaine anstelle von 0,1% Agarose und 200 mg / L für die Montage. Methylcellulose ist viskoser als 0,1% Agarose wodurch höhere Immobilität auf eigene und weniger Tricaine muss verwendet werden, um eine Begrenzung des Embryos zu gewährleisten.
Tricaine empfindlich auf Temperaturen über 30 ° C und kann auch durch das Medium in der Belichtungskammer verdünnt werden, was zu einer verringerten Leistung und mögliche Zucken des Embryos. Stellen Sie daher sicher, dass Sie Tricaine auch in der Abbildungsmedium, in dem die Probe eingetaucht montiert zu verwenden. Wenn Ihre Experimente erfordern die Verwendung von höherenTemperaturen empfehlen wir den Austausch des Mediums in der Abbildungskammer entweder ständig unter Verwendung einer Perfusionssystem oder manuell mit einem Rohr und einer Spritze zwischen zwei Zeitpunkten.
Kritische Schritte
Die kritischen Schritte im Prozess der Montage sind die Probenaufnahme der Probe in das Rohr und das Einführen des Agarose-Stopfen. Die Einlass definiert die Anfangsposition des Embryos, die umständlich nachträglich ändern ist. Mehrere Proben sollten zu montieren sein und die Montagequalität sollte mit einem Stereomikroskop beobachtet werden. Wenn die Probe Orientierung nicht zufriedenstellend ist, die Änderung der Geschwindigkeit von der Erstellung der Probe und die Vermeidung von Folgebewegungen der Kolben kann helfen, wie dies oft verdreht den Embryo. Die 1,5%-Agarose-Stopfen erforderlich ist, um eine Leckage des 0,1%-igen Agarose vermeiden. Die Oberfläche des Stopfens im Inneren des Rohres sollte flach auf den Probenorientierung während der Entwicklung nicht zu beeinflussen. Um eine gute Surf erreichenace, unterschiedliche Dicken der Schichten Agarose müssen getestet werden und das Rohr muss in der Agarose normal zu der Oberfläche gebracht werden. Drehen der Röhre ein wenig und ziehen den Schlauch heraus sorgfältig frei den Stecker aus der Schüssel. Die Qualität der Befestigung sollte mit einem Stereomikroskop geprüft werden vor der Bilderzeugung.
Multiview-Bild
Ein großer Vorteil der Lichtbogen-Mikroskopie ist Multiview-Bildgebung, die Fähigkeit, um die Probe zu drehen, zu erwerben z-Stapel aus verschiedenen Blickwinkeln und in der Folge zu registrieren und verschmelzen sie. Eine etablierte Methode, um die z-Stacks im 3D-Raum zu registrieren ist Wulst-basierte Registrierung unter Verwendung von fluoreszierenden Kügelchen die Probe umgebenden als Treuhänder 17 Marker. Dieses Verfahren beruht jedoch auf einem festen Einbettungsmedium, wie 1,5% Agarose und scheint daher mit der mehrschichtige Montage hier vorge unvereinbar. Aber mehrere alternative Lösungen zu arbeiten, je nach Anwendung. Erstens kann die fluoreszierende Kügelchenin der Agarose-Stecker, der in das Sichtfeld während der Erfassung werden muss aufgenommen werden. Zweitens können die Tischpositionen vor den eigentlichen Versuche unter Verwendung eines 1,5% Agarose-Säule, die mit fluoreszierenden Kügelchen kalibriert werden. Drittens können alternative Marker, wie Fluoreszenz Kerne verwendet, um die Position der Z-Stapel relativ zueinander zu identifizieren.
Verdunstung
Typische Lichtschnittmikroskopie Setups einen offenen Probenkammer, die unvermeidlich führt zur Verdampfung des Mediums. Da das Medium ist essentiell für das Überleben der Probe, um die Verdampfung des Montagemedium zu beschränken und für die richtige Brechungsindex zwischen der Optik und der Probe, empfehlen wir unter einer oder mehreren der folgenden Maßnahmen, um Verdunstung zu verhindern. Erstens kann das Medium in der Kammer ständig ein Perfusionssystem ausgetauscht werden. Zweitens kann das Medium manuell nachgefüllt werden. Drittens kann die Kammer mit einem Deckel oder einer flexiblen Folie abgedeckt werden.
<pclass = "jove_step"> SauerstoffversorgungDas Polymer FEP wurde entwickelt, um eine große Vielzahl von Chemikalien zu widerstehen und ist daher robust, chemisch inert und undurchlässig für Gas. Im Fall von mehrschichtigen Montage Sauerstoff kann nur durch die Agarose-Stopfen und dem Agarose-Luft-Grenzfläche zu durchdringen, aber es bleibt zu zeigen, wenn die Sauerstoffzufuhr in mehrschichtigen Montage ist erheblich niedriger im Vergleich zu den Einbau in 1,5% Agarose-Polymer ohne Stützrohr. Da die Montage in 1,5% Agarose kann nur für etwa zwei Stunden verwendet werden, bevor der Zebrafisch Morphologie mehrschichtigen Montage betroffen sein scheint, die überlegene Gesamtlösung für die Langzeitabbildungs sein.
Abbilden früheren Entwicklungsstufen
Multilayer-Montage ist nun unsere Standard-Einbettungstechnik für Zeitraffer-Mikroskopie von Lichtbogen Zebrafisch älter als 24 hpf zu werden. Außer, dass wir auch die Polymerrohren für die Bildgebung von früher Embryonen zu verwenden. Die Embryos bleiben in ihrer Chorion und in einer FEP-Röhre mit einem Innendurchmesser von 1 mm angeordnet und mit E3 gefüllt. Der Zebrafisch kann frei innerhalb des Chorion entwickelt und kann immer noch gut mit Hilfe von Licht-Mikroskopie Blatt abgebildet werden.
Ausblick
Die vorgestellte Mehrschichtprobe Montage entfesselt das volle Potential der Lichtblatt-Mikroskopie für Echtzeit-Entwicklungsbiologie mit Zebrafisch. Es kann leicht für andere Mikroskopietechniken wie optischen Projektionstomographie (OPT) und andere Organismen angenommen werden. Wir glauben, dass die Standard-Größe FEP Schläuche sind nur die ersten Schritte in Richtung Probe Montagetechniken für die spezifischen Bedürfnisse zugeschnitten sind.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken der Max-Planck-Gesellschaft, das Human Frontier Science Program (HFSP) und der Boehringer Ingelheim Fonds für die Finanzierung und Unterstützung.
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes | Bola | S 1815-04 | 0.8 / 1.6 mm inner / outer diameter, other sizes available |
Omnifix-F Solo 1 ml Syringe | B. Braun Melsungen AG | 9161406 V | |
Sterican Single-Use Cannula, blunt | B. Braun Melsungen AG | 9180109 | 0.8 x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube |
50 ml Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
1 M NaOH | |||
0.5 M NaOH | |||
70% EtOH | |||
Methylcellulose | Sigma | M0387 | supplied as powder |
E3 medium (for zebrafish embryos) | |||
1.5 ml Reaction Tube | Eppendorf | 3810X | |
Agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414 | supplied as powder |
Petri Dish | Greiner | 633180 | plastic, 94 x 16 mm |
Tricaine | Sigma | E10521 | synonyms: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate |
10x/0.3 W Microscope Objective Lens | Leica | HCX APO L | |
EMCCD Camera | Andor Technology | iXon 885 EMCCD |