Le développement de poisson zèbre peut être suivie au fil des jours avec la microscopie nappe de lumière lorsque les embryons sont incorporés dans des tubes de polymères optiquement transparents à faible concentration d'agarose.
Feuille microscopie optique est la technique d'imagerie idéal pour étudier le développement embryonnaire du poisson zèbre. En raison de la photo-toxicité et blanchiment minime, il est particulièrement adapté pour l'imagerie time-lapse à long terme sur plusieurs heures jusqu'à plusieurs jours. Cependant, une stratégie de fixation appropriée de l'échantillon est nécessaire qui offre à la fois le confinement et le développement normal de l'échantillon. Multicouche de montage, une nouvelle technique d'enrobage à l'aide de faible concentration d'agarose dans des tubes optiquement transparents, surmonte maintenant cette limitation et libère le plein potentiel de la microscopie à feuille de lumière en temps réel la biologie du développement.
Pour comprendre les événements complexes et des interactions au cours de l'embryogenèse, la recherche en biologie du développement est de plus en plus mobile de la microscopie de cellules et d'organes simples à l'imagerie in vivo d'organismes entiers. Les techniques traditionnelles de microscopie ne généralement à offrir la résolution spatiale et temporelle de suivre les événements rapides sur une longue période de temps et provoquent le blanchiment ou les effets phototoxiques de l'échantillon 1 souvent. Nous et d'autres avons trouvé microscopie nappe de lumière (figure 1) soit la technique idéale pour l'imagerie in vivo de poisson zèbre 2-4. L'illumination de l'échantillon avec une feuille mince de lumière laser, orthogonal à l'axe de détection, propose un sectionnement optique rapide à haute résolution spatiale réduite au minimum ainsi que la photo-toxicité 5. Dans le même temps, en raison de cet agencement optique unique, les techniques de montage d'échantillon traditionnels utilisant des boîtes de Pétri ou des chambres de culture ne sont pas adaptés. Dans une lumière typiquefeuille microscope trois moteurs de translation et de rotation d'un moteur détiennent l'échantillon, de telle sorte qu'il peut être positionné avec précision, tournés et visualisées à partir de n'importe quelle direction. Dans les spécimens dernières pour la microscopie nappe de lumière ont souvent été embarqué dans 1-2% d'agarose dans un capillaire en verre 6,7. Dans ce cas, le cylindre d'agarose solidifié avec l'échantillon embarqué est extrudée hors du tube capillaire en verre dans la chambre de mesure remplie de l'eau comme milieu de formation d'image. Agarose a un indice de réfraction proche de l'eau et est donc parfaitement adapté pour la microscopie nappe de lumière in vivo qui facilite l'optique d'illumination et de détection corrigé à l'eau. L'échantillon est confiné dans l'agarose rigide et peut être bien imagée pour une courte période de temps, mais les changements morphogénétiques et la croissance de l'embryon sont fortement compromise lors de l'imagerie pendant plusieurs heures 7,8. Bien que des solutions pour d'autres applications ont été développées 9, la non invasive à long terme time-lapse de poisson zèbre potentiel de formation d'image de microscopie à nappe de lumière ne peut pas être exploitée en utilisant le plongement classique d'agarose à 1,5%.
Nous avons donc développé une nouvelle stratégie de montage pour la microscopie nappe de lumière in vivo des embryons de poisson zèbre 10. L'échantillon est monté dans 0,1% d'agarose avec 200 mg / L Tricaine l'intérieur d'un tube en polymère fluoré d'éthylène optiquement clair propylène (FEP). L'embryon se développe normalement intégré raison de la faible viscosité du milieu. Dans le même temps, le tube FEP confine le support et l'échantillon pour la durée de l'expérience. Ici, nous fournissons un protocole détaillé de la nouvelle technique de montage et présenter des données reflétant ses avantages sur le protocole classique. Nous démontrons que notre méthode de développement du poisson zèbre peut être imagée en continu avec une résolution spatiale et temporelle sur une période de plus de deux jours.
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Figure 1. Le principe de la microscopie de nappe de lumière. Un poisson zèbre monté dans un tube en éthylène propylène fluoré (FEP) peut être traduit et mis en rotation à travers le plan focal de l'objectif de détection. Une mince feuille de lumière laser (nappe de lumière) est projetée par l'objectif d'éclairage dans le plan focal de l'objectif de détection et illumine seulement une section optique mince de l'échantillon. Le signal de fluorescence émise est collectée par l'objectif de détection et enregistrée sur une puce de caméra.
Techniques de microscopie de pointe telles que la microscopie de nappe de lumière nous permettent d'enregistrer des données d'image avec une résolution spatiale et temporelle au cours de plusieurs jours, mais aussi nécessitent des techniques de montage d'échantillons à améliorer. Nous présentons un protocole détaillé de multicouche de montage pour la microscopie nappe de lumière de développement du poisson zèbre. La méthode est simple à mettre en œuvre et nous l'utilisons dans notre laboratoire sur une base quotidienne.
Les tubes FEP
Les éléments clés de notre stratégie de montage sont des tubes en l'éthylène propylène fluoré polymère (FEP). Nous avons décidé d'utiliser FEP principalement en raison de son indice de réfraction de 1,338, ce qui est similaire à l'eau et donc parfaitement adapté pour la microscopie nappe de lumière avec les objectifs de l'eau de trempage et de spécimens nécessitant des milieux aqueux. Les tubes de 0,8 mm de diamètre intérieur et de 0,4 mm d'épaisseur de paroi adapter le poisson zèbre développe très bien, peuvent être utilisés avec des porte-échantillons typiques adaptés à 1,6 mmcapillaires et sont notre premier choix pour la méthode de fixation présenté. Nous avons testé à fond dans nos configurations assemblés ainsi que dans le système commercial "Lightsheet Z.1" par Carl Zeiss Microscopie et constaté que les tubes FEP offrir une stabilité à long terme, avoir qu'un impact minimal sur les performances optiques et sont non fluorescent 10. Ils sont, cependant, ne conviennent pas pour des applications avec des échantillons qui nécessitent un indice de réfraction différent, par exemple effacé spécimen.
Les tubes ainsi que des feuilles faites de FEP sont disponibles dans une variété de diamètres et épaisseurs. En outre, le FEP peut être fondu à 260 ° C et offre des possibilités quasi infinies pour l'échantillon des supports de montage sur mesure ainsi. Les tubes de polymère ont tendance à être fourni non stérile, ce qui explique pourquoi le protocole de nettoyage comprend plusieurs mesures pour assurer la meilleure qualité optique. Le revêtement avec de la méthylcellulose garantit qu'aucune partie de l'embryon de poisson zèbre croissante colle au polymère.
<p class = "jove_step"> Le milieu de montageLa décision pour 0,1% d'agarose est basée sur des tests approfondis de taux et de l'immobilité de croissance à différentes concentrations de l'agarose et la méthylcellulose 10. Concentrations supérieures à 0,1% d'agarose ont déjà montré un impact grave sur le taux de 24 HPF poisson zèbre de croissance. En outre, nous utilisons de faibles doses de la drogue anesthésiante Tricaine. les potentiels des blocs de tricaïne d'action, inhibe ainsi la transmission des signaux entre le cerveau et les muscles et supprime les contractions musculaires 16. Une concentration de 133 à 200 mg / L assure l'immobilisation suffisante de poisson zèbre entre 24-72 HPF. Cependant, Tricaine et d'autres médicaments anesthésiants nous avons testé les effets secondaires dépendent spectacle de doses telles que l'oedème cardiaque. En outre, la dose requise de tricaïne varie avec le stade de développement de l'embryon. Nous recommandons donc de réduire la concentration Tricaine à la quantité nécessaire pour les stades de développement qui sont imagés. Pour assurer la meilleure performanCE et éviter la formation de sous-produits toxiques, solution stock Tricaine fraîchement préparée ou décongelé doit être utilisé, protégé de la lumière et non chauffé au-dessus de 30 ° C.
L'intégration dans des tubes FEP permet également de modifier facilement le milieu de montage pour tenir compte des besoins spécifiques. Pour l'imagerie time-lapse du cœur, nous vous recommandons d'utiliser 3% de méthylcellulose et 100 mg / L Tricaine au lieu de 0,1% d'agarose et 200 mg / L pour le montage. La méthylcellulose est plus visqueux que 0,1% d'agarose fournissant ainsi l'immobilité plus haut sur sa propre tricaïne et moins qui doit être utilisé pour assurer le confinement de l'embryon.
Tricaïne est sensible à des températures supérieures à 30 ° C et peut également être diluée par le fluide dans la chambre d'imagerie, ce qui conduit à une baisse des performances et des contractions possible de l'embryon. Par conséquent, assurez-vous d'utiliser Tricaine également dans le milieu de l'imagerie dans lequel le spécimen monté est immergé. Si les expériences nécessitent l'utilisation ultérieure detempératures, il est recommandé changeant le milieu dans la chambre d'imagerie soit constamment en utilisant un système de perfusion ou manuellement avec un tube et une seringue entre deux points dans le temps.
Les étapes critiques
Les étapes critiques au cours du processus de montage de l'échantillon sont l'admission de l'échantillon dans le tube et l'insertion du bouchon d'agarose. L'apport définit la position initiale de l'embryon, qui est encombrant pour changer par la suite. Spécimens multiples devraient être disponibles pour monter et la qualité de montage doivent être surveillées avec une loupe binoculaire. Si l'orientation de l'échantillon n'est pas satisfaisante, la modification de la vitesse de l'élaboration de l'échantillon et éviter les mouvements ultérieurs du plongeur peut aider que ce tord souvent l'embryon. Le bouchon d'agarose à 1,5% est nécessaire pour éviter les fuites de l'agarose à 0,1%. La surface de la fiche à l'intérieur du tube doit être plat pour ne pas influencer l'orientation de l'échantillon au cours du développement. Pour atteindre un bon surfas, différentes épaisseurs des couches d'agarose doivent être testés et le tube doit être mis dans l'agarose normale à la surface. Tourner le tube un peu et en tirant le tube libère attentivement la fiche de l'antenne. La qualité du montage doit être vérifiée avec un stéréomicroscope avant l'imagerie.
imagerie de Multiview
Un avantage majeur de la microscopie à feuille de lumière est l'imagerie multi-vues, la capacité de faire tourner l'échantillon, acquérir z-piles sous des angles multiples et ensuite enregistrer et de les fusionner. Une méthode établie pour enregistrer les z-piles dans l'espace 3D est l'enregistrement sur la base de perles en utilisant des billes fluorescentes autour de l'échantillon en tant que marqueurs fiduciaires 17. Cette méthode repose toutefois sur un support de montage solide tel que 1,5% d'agarose et semble donc incompatible avec le multicouche montage présenté ici. Mais plusieurs solutions alternatives fonctionnent selon l'application. Tout d'abord, les perles fluorescentes peutdoit être intégré dans le bouchon d'agarose, qui doit être dans le champ de vision au cours de l'acquisition. D'autre part, les positions de la scène peuvent être étalonnés avant les expériences réelles en utilisant une colonne d'agarose à 1,5% avec des billes fluorescentes. Troisièmement, les marqueurs de substitution tels que les noyaux fluorescents peuvent être utilisés pour identifier la position des empilements z par rapport à l'autre.
Évaporation
Typiques des configurations de microscopie nappe de lumière utilisent une chambre d'échantillon ouvert, qui conduit inévitablement à l'évaporation du milieu. Depuis le milieu est essentiel pour la survie de l'échantillon, pour limiter l'évaporation du milieu de montage et de l'indice de réfraction correcte entre l'optique et de l'échantillon, nous recommandons de prendre une ou plusieurs des mesures suivantes pour éviter l'évaporation. Tout d'abord, le milieu dans la chambre peut être échangée en permanence par un système de perfusion. En second lieu, le milieu peut être rempli manuellement. En troisième lieu, la chambre peut être recouvert d'un couvercle ou d'une feuille flexible.
<pclass = "jove_step"> fourniture d'oxygèneLe FEP de polymère a été mise au point pour résister à une grande variété de produits chimiques et est donc robuste, chimiquement inerte et non perméable au gaz. Dans le cas de plusieurs couches de montage oxygène ne peut pénétrer à travers le bouchon d'agarose et l'interface agarose-air, mais il reste à démontrer si l'apport d'oxygène dans le montage multicouche est fortement inférieur à celui de monter à 1,5% d'agarose sans tube support polymère. Cependant, comme dans le montage de 1,5% d'agarose ne peut être utilisé pendant environ deux heures avant la morphologie du poisson zèbre est affectée montage multicouche semble être la meilleure solution globale pour l'imagerie à long terme.
Imagerie premiers stades de développement
Multicouche de montage est devenu notre technique d'encastrement standard pour feuille de lumière time-lapse microscopie de poisson zèbre âgés de plus de 24 HPF. En plus de cela, nous utilisons également des tubes de polymères pour l'imagerie des embryons de stade précoce. L'embryos restent dans leurs chorions et sont montés dans un tube en FEP avec un diamètre interne de 1 mm et remplis de E3. Le poisson zèbre peut développer librement à l'intérieur du chorion et peut encore être imagé bien en utilisant la microscopie nappe de lumière.
Perspective
Le montage de l'échantillon multicouche présenté libère le plein potentiel de la microscopie à feuille de lumière en temps réel la biologie du développement avec le poisson zèbre. Il peut facilement être adoptée pour d'autres techniques de microscopie comme la tomographie à projection optique (OPT) et d'autres organismes. Nous croyons que les tubes FEP taille standard ne sont que les premiers pas vers les techniques de montage d'échantillons sur mesure pour des besoins spécifiques.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions la Société Max Planck, le Human Frontier Science Program (HFSP) et le Fonds Boehringer Ingelheim pour le financement et le soutien.
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes | Bola | S 1815-04 | 0.8 / 1.6 mm inner / outer diameter, other sizes available |
Omnifix-F Solo 1 ml Syringe | B. Braun Melsungen AG | 9161406 V | |
Sterican Single-Use Cannula, blunt | B. Braun Melsungen AG | 9180109 | 0.8 x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube |
50 ml Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
1 M NaOH | |||
0.5 M NaOH | |||
70% EtOH | |||
Methylcellulose | Sigma | M0387 | supplied as powder |
E3 medium (for zebrafish embryos) | |||
1.5 ml Reaction Tube | Eppendorf | 3810X | |
Agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414 | supplied as powder |
Petri Dish | Greiner | 633180 | plastic, 94 x 16 mm |
Tricaine | Sigma | E10521 | synonyms: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate |
10x/0.3 W Microscope Objective Lens | Leica | HCX APO L | |
EMCCD Camera | Andor Technology | iXon 885 EMCCD |