Lo sviluppo di zebrafish può essere seguita nel giorni con microscopio foglio leggero, quando gli embrioni sono inserite in tubi polimerici otticamente trasparenti con bassa concentrazione di agarosio.
Foglio di microscopia ottica è la tecnica di imaging ideale per studiare lo sviluppo embrionale zebrafish. Grazie alla minima foto-tossicità e sbiancamento, è particolarmente adatto per il lungo termine time-lapse imaging per molte ore fino a diversi giorni. Tuttavia, è necessaria una strategia di montaggio campione adeguato che offre sia il parto e lo sviluppo normale del campione. Multistrato di montaggio, una nuova tecnica di incorporamento con bassa concentrazione di agarosio in tubi otticamente chiaro, ora supera questa limitazione e scatena il pieno potenziale della microscopia foglio leggero in tempo reale biologia dello sviluppo.
Per capire gli eventi complessi e interazioni durante l'embriogenesi, la ricerca in biologia dello sviluppo è sempre più passando da microscopia di singole cellule e organi di immagini in vivo di interi organismi. Tradizionali tecniche di microscopia tipicamente non riescono ad offrire la risoluzione spaziale e temporale per seguire eventi rapidi per un lungo periodo di tempo e sono spesso causa di sbiancamento o effetti fototossiche nel campione 1. Noi e altri abbiamo trovato microscopia ottica foglio (Figura 1) sia la tecnica ideale per l'imaging in vivo di zebrafish 2-4. L'illuminazione del campione con un sottile foglio di luce laser, ortogonale all'asse di rilevamento, offre sezionamento ottico veloce con alta risoluzione spaziale e minimizzato fototossicità 5. Allo stesso tempo, a causa di questa disposizione ottica unica, tecniche di montaggio tradizionale campione utilizzando piastre Petri o camere di coltura non sono adatti. In una luce tipicamicroscopio foglio tre motori traslazionali e un motore di rotazione tengono il campione, in modo da poter essere posizionato precisamente, trasformate e visualizzati da qualsiasi direzione. Negli ultimi campioni per la microscopia foglio leggero sono stati spesso incorporato nel 1-2% agarosio all'interno di un capillare di vetro 6,7. In questo caso il cilindro agarosio solidificato con il campione incorporate viene estruso dal capillare di vetro nell'apposita camera occupato dal mezzo acquosa per l'imaging. Agarosio ha un indice di rifrazione vicino all'acqua ed è quindi perfettamente adatto per microscopia foglio leggero in vivo che facilita corretta acqua-illuminazione e rilevazione ottica. Il campione viene confinato nella agarosio rigido e può essere ripreso bene per un breve periodo di tempo, ma cambiamenti morfogenetici e crescita dell'embrione sono fortemente compromessa quando l'imaging per diverse ore 7,8. Sebbene siano state sviluppate soluzioni per altre applicazioni 9, la non invasiva a lungo termine time-lapse zebrafish potenziale di imaging della microscopia foglio leggero non può essere sfruttata utilizzando il tradizionale 1,5% agarosio incorporamento.
Abbiamo quindi sviluppato una nuova strategia per il montaggio in vivo microscopia ottica di embrioni di zebrafish 10 fogli. Il campione è montato in 0,1% di agarosio con 200 mg / L Tricaine dentro un tubo del otticamente trasparente polimero fluorurato etilene-propilene (FEP). L'embrione incorporato sviluppa normalmente a causa della bassa viscosità del mezzo. Allo stesso tempo, il tubo FEP limita il mezzo e il campione per la durata dell'esperimento. Qui forniamo un protocollo dettagliato della nuova tecnica di montaggio e dati presenti riflettente suoi vantaggi rispetto al protocollo convenzionale. Abbiamo dimostrato che con il nostro sviluppo zebrafish metodo può essere continuamente ripreso con elevata risoluzione spaziale e temporale in un periodo di più di due giorni.
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Figura 1. Il principio di microscopia foglio leggero. A zebrafish montato in un tubo in etilene propilene fluorurato (FEP) può essere tradotto e ruotato il piano focale dell'obiettivo rilevamento. Un foglio sottile di luce laser (foglio leggero) è proiettata dall'obiettivo illuminazione nel piano focale dell'obiettivo rilevamento e illumina solo una sezione ottica sottile del campione. Il segnale di fluorescenza emessa viene raccolta dall'obiettivo rilevamento e registrato su un chip fotocamera.
Tecniche di microscopia avanzata come la microscopia foglio leggero ci consentono di registrare i dati di immagine con alta risoluzione temporale e spaziale nel corso di diversi giorni, ma richiedono anche tecniche di montaggio di esempio per migliorare. Vi presentiamo un protocollo dettagliato di montaggio per la microscopia foglio leggero dello sviluppo zebrafish multistrato. Il metodo è semplice da implementare e lo usiamo nel nostro laboratorio su una base quotidiana.
I tubi FEP
I componenti chiave della nostra strategia di montaggio sono tubi fatti di etilene propilene fluorurati polimero (FEP). Abbiamo deciso di utilizzare FEP soprattutto a causa del suo indice di rifrazione di 1,338, che è simile all'acqua e quindi ideale per microscopia foglio leggero con obiettivi acqua-immersione e di campioni che richiedono mezzi acquosi. I tubi con 0,8 millimetri di diametro interno e 0,4 mm di spessore montare il pesce zebra in via di sviluppo molto bene, possono essere utilizzati con supporti tipici esempi adatti a 1,6 millimetricapillari e sono la nostra prima scelta per il metodo di montaggio presentato. Li abbiamo testato a fondo nelle nostre configurazioni in casa costruita così come nel sistema commerciale "Lightsheet Z.1" di Carl Zeiss Microscopy verificando che i tubi FEP offrire stabilità a lungo termine, hanno solo un impatto minimo sulle prestazioni ottiche e sono non fluorescente 10. Sono, tuttavia, non adatti per applicazioni con campioni che richiedono un indice di rifrazione diverso, ad esempio eliminato campione.
Tubi e lamine in FEP sono disponibili in una varietà di diametri e spessori. Inoltre, FEP può essere fuso a 260 ° C e quindi offre possibilità pressoché infinite di supporti di montaggio del campione su misura. I tubi polimerici tendono ad essere fornito non sterile, motivo per cui il protocollo di pulizia incorpora diverse misure per garantire la migliore qualità ottica. Il rivestimento di metilcellulosa assicura che nessuna parte della crescente zebrafish si attacca al polimero.
<p class = "jove_step"> Il mezzo di montaggioLa decisione di 0,1% agarosio si fonda su ampie prove di crescita e immobilità in diverse concentrazioni di agarosio e metilcellulosa 10. Concentrazioni superiori allo 0,1% agarosio già mostrato un forte impatto sul tasso di crescita del 24 HPF zebrafish. Inoltre usiamo basse dosi del farmaco Tricaine anestetizzante. Potenziali d'azione blocchi tricaine, inibisce così la trasmissione del segnale tra cervello e muscoli e sopprime contrazioni muscolari 16. Una concentrazione di 133-200 mg / L assicura sufficiente immobilizzazione di zebrafish tra 24-72 HPF. Tuttavia, Tricaine e altre droghe anestetizzante abbiamo testato spettacolo dosi effetti collaterali dipendenti come edema cardiaco. Inoltre, la dose richiesta di Tricaine varia con lo stadio di sviluppo dell'embrione. Si consiglia pertanto di ridurre la concentrazione Tricaine all'importo necessario per le fasi di sviluppo che vengono esposte. Per garantire la migliore prestazioce e prevenire la formazione di sottoprodotti tossici, soluzione stock Tricaine preparata di fresco o scongelato deve essere usato, al riparo dalla luce e riscaldamento non superiore a 30 ° C.
L'embedding in tubi FEP consente inoltre di facile modifica del mezzo di montaggio per tenere conto di esigenze specifiche. Per time-lapse imaging del cuore, si consiglia di utilizzare il 3% di metilcellulosa e 100 mg / L Tricaine invece del 0,1% agarosio e 200 mg / L per il montaggio. La metilcellulosa è più viscoso 0,1% agarosio fornendo così maggiore immobilità propria e meno Tricaine deve essere utilizzato per assicurare confinamento dell'embrione.
Tricaine è sensibile a temperature superiori a 30 ° C e può anche essere diluito dal fluido nella camera di imaging, conseguente diminuzione delle prestazioni e possibili contrazioni dell'embrione. Pertanto, assicurarsi di utilizzare Tricaine anche nel mezzo di imaging in cui il campione montato è immerso. Se i vostri esperimenti richiedono l'uso di una maggioretemperature, si raccomanda di cambiare il mezzo nella camera di imaging sia costantemente utilizzando un sistema di perfusione o manualmente con un tubo e una siringa tra due punti temporali.
Passaggi critici
I passaggi critici durante il processo di montaggio del campione sono le aspirazione del campione nella provetta e l'inserimento della spina agarosio. L'assunzione definisce la posizione iniziale dell'embrione, che è ingombrante cambiare dopo. I campioni multipli devono essere disponibili per montare e la qualità di montaggio devono essere monitorati con uno stereomicroscopio. Se l'orientamento del campione non è soddisfacente, alterando la velocità di elaborazione del campione e di evitare successivi movimenti del pistone può aiutare in quanto spesso stravolge l'embrione. La spina agarosio 1,5% è necessario per evitare perdite di agarosio 0,1%. La superficie del tappo all'interno del tubo deve essere piatta per non influenzare l'orientamento campione durante lo sviluppo. Per ottenere una buona navigazioneasso, differenti spessori degli strati di agarosio devono essere testati e il tubo deve essere messo in agarosio normale alla superficie. Ruotando il tubo un po 'e tirando il tubo rilascia cautela la spina dal piatto. La qualità del montaggio deve essere verificata con uno stereomicroscopio prima di imaging.
Immagini Multiview
Uno dei principali vantaggi della microscopia foglio leggero è l'imaging MultiView, la possibilità di ruotare il campione, acquisire z-stack da più angolazioni e successivamente registrare e fonderli. Un metodo stabilito per registrare i z-stack in uno spazio 3D è basato bead-registrazione utilizzando perline fluorescenti che circondano il campione come marcatori fiduciari 17. Questo metodo però si basa su un mezzo di montaggio solido come 1,5% agarosio e sembra quindi incompatibile con il multistrato montaggio presentato qui. Ma diverse soluzioni alternative funzionano a seconda dell'applicazione. In primo luogo, le perline fluorescenti possonoessere incorporato nella spina agarosio, che deve essere nel campo visivo durante l'acquisizione. In secondo luogo, le posizioni di fase possono essere calibrati prima degli esperimenti reale utilizzando una colonna di agarosio 1,5% con perline fluorescenti. Terzo, marcatori alternativi come nuclei fluorescenti possono essere usati per identificare la posizione di Z-stack rispetto all'altro.
Evaporazione
Tipiche configurazioni microscopia foglio leggero usa una camera del campione aperta, che inevitabilmente porta a vaporizzazione del fluido. Poiché il mezzo è essenziale per la sopravvivenza del campione, per limitare l'evaporazione del mezzo di montaggio e per l'indice di rifrazione corretta tra ottica e di esempio, si consiglia di prendere una o più delle seguenti misure per prevenire l'evaporazione. In primo luogo, il mezzo nella camera può essere costantemente scambiato da un sistema di perfusione. In secondo luogo, il mezzo può essere riempito manualmente. Terzo, la camera può essere coperto con un coperchio o una lamina flessibile.
<pclass = "jove_step"> fornitura di ossigenoIl FEP polimero è stato sviluppato per resistere ad una grande varietà di prodotti chimici ed è quindi robusto, chimicamente inerte e nonpermeable a gas. Nel caso di montaggio multistrato ossigeno può penetrare solo attraverso la spina agarosio e l'interfaccia agarosio-aria, ma resta da dimostrare se l'apporto di ossigeno nel montaggio multistrato è notevolmente inferiore rispetto al montaggio in 1,5% agarosio senza tubo portante polimerica. Tuttavia, come il montaggio in 1,5% agarosio può essere utilizzato solo per circa due ore prima della morfologia zebrafish è influenzato montaggio multistrato sembra essere la soluzione complessiva superiore per l'imaging a lungo termine.
Imaging precedenti fasi di sviluppo
Multistrato di montaggio è ormai diventata la nostra tecnica incasso standard per la microscopia di zebrafish di età superiore a 24 hpf foglio leggero time-lapse. Oltre a questo, usiamo anche i tubi polimerici per l'imaging dei primi embrioni stadio. L'indirizzo embryos rimangono nelle loro chorions e sono montati in un tubo FEP con diametro interno di 1 mm e riempiti con E3. Il pesce zebra in grado di svilupparsi liberamente all'interno del corion e può ancora essere ripreso anche utilizzando la microscopia foglio leggero.
Prospettiva
Il montaggio del campione multistrato presentato scatena il pieno potenziale della microscopia foglio leggero in tempo reale biologia dello sviluppo con zebrafish. Può essere facilmente adottata per altre tecniche di microscopia come la tomografia ottica di proiezione (OPT) e di altri organismi. Noi crediamo che i tubi FEP dimensioni standard sono solo i primi passi verso tecniche di montaggio del campione su misura per esigenze specifiche.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo il Max Planck Society, il Programma Human Frontier Science (HFSP) e la Boehringer Ingelheim Fonds per il finanziamento e il sostegno.
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes | Bola | S 1815-04 | 0.8 / 1.6 mm inner / outer diameter, other sizes available |
Omnifix-F Solo 1 ml Syringe | B. Braun Melsungen AG | 9161406 V | |
Sterican Single-Use Cannula, blunt | B. Braun Melsungen AG | 9180109 | 0.8 x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube |
50 ml Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
1 M NaOH | |||
0.5 M NaOH | |||
70% EtOH | |||
Methylcellulose | Sigma | M0387 | supplied as powder |
E3 medium (for zebrafish embryos) | |||
1.5 ml Reaction Tube | Eppendorf | 3810X | |
Agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414 | supplied as powder |
Petri Dish | Greiner | 633180 | plastic, 94 x 16 mm |
Tricaine | Sigma | E10521 | synonyms: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate |
10x/0.3 W Microscope Objective Lens | Leica | HCX APO L | |
EMCCD Camera | Andor Technology | iXon 885 EMCCD |