Модифицированный Осадки Метод изолировать мочевых экзосомы
Summary
This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.
Abstract
Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.
Introduction
Мочевой экзосомы небольшие внутренние пузырьки 100 нм мультивезикулярных органов (MVB), полученных из клеток всех типов в нормальных и патологических условиях в моче пространства, включая клубочков подоцитов, клетках почечных канальцев и клеток, выстилающих мочевые системы дренажа, которые появляются в обогащении микроРНК 1 -2. Многие исследователи обнаружили различные белки в экзосом, выделенных из мочи здоровых лиц, а также пациентов с почечной и / или системными заболеваниями 3-5. Экзосомы может быть выделен с помощью различных методов, таких как двухступенчатой дифференциального ультрацентрифугирования с или без сахарозы 6-7, комбинируя наномембраны фильтр ультрацентрифугирования 8-9 или 10-11 осадков. Мы недавно разработали простой, быстрый, масштабируемый и эффективный метод, чтобы изолировать мочевых экзосомы и выявления микроРНК и белка биомаркеров 11. Хотя биомаркеры могут быть обнаружены в самых разных биологических жидкостях, игине является наиболее удобен для больных с заболеваниями почек и мочевого тракта, поскольку он может быть получен в больших количествах в относительно неинвазивным способом.
Хотя существует несколько методов, чтобы изолировать мочевого экзосомы 6-11, наиболее часто используемые процедуры, зависит от дифференциального ультрацентрифугирования с 30% сахарозы подушке. В то время как этот способ является эффективным и качество получаемых экзосом изолированных с этой процедурой является высокой, сама техника требует квалифицированного персонала и отнимает много времени и требует несколько шагов ультрацентрифугирования. Другие методы, такие как фильтрация и осадков, были разработаны для изоляции экзосом, в том числе тот, который использует запатентованную осадков реагент (т.е. ExoQuick-TC: Система биологических наук; Mountain View, CA). Хотя осадков использованием этого реагента очень быстро и сравнительно легко, чистота выделенных экзосом является низкой по сравнению с ультрацентрифугирования метOD. Мы недавно сравнил шесть методов для выделения в моче экзосом, в том числе модификации метода осаждения с использованием ExoQuick-TC, которые мы разработали в нашей лаборатории 11. Мы обнаружили, что этот модифицированный способ осадков дали более высокие количества белка, микроРНК, и мРНК и сама процедура была быстрее и проще в реализации, чем ультрацентрифугированием. Здесь мы опишем экспериментальный протокол нашего модифицированного метода осаждения ступенчато, и включают в себя обсуждение преимуществ и недостатков этого метода по сравнению с другими методами изоляции экзосома. Модифицированный метод осаждения включает начальное осаждение частиц экзосом, с последующим удалением Тамм-Хорсфолл белка, который коррелирует с exosomal белков, и известно, снижают экзосома выход из мочи. Мы обнаружили, что эти модификации повышает выход и чистоту препарата exosomal из мочи.
Protocol
Representative Results
Discussion
Большинство методов с участием осаждение экзосом из мочи не учитывают удаление полимерного сети, образованной Тамм-Хорсфолл белка (ТНР). Этот белок присутствует в больших количествах в моче, где предположительно ловушки экзосомы во время начальной низкоскоростным центрифугированием…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Roney Family Foundation for the support of this study. We acknowledge the contribution of Dr. M. Lucrecia Alvarez to the planning and execution of the experiments described in this work.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Corning 15ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12 % Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
Referencias
- Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease. Kidney Int. 78, 191-199 (2010).
- Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).
- Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).
- Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation. Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).
- Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. Isolation and purification of exosomes in urine. Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).
- Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery. Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).
- Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).
- Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).
- Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes. J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).
- Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea. Renal Fail. 29, 693-698 (2007).
