FIBS-enabled non invasiva Metabolic Profiling

Summary

Una descrizione di come calibrare trasferimento Förster Resonance Energy sensori biologici integrati (FIBS) per in situ profilo metabolico è presentato. Le FIBS possono essere utilizzati per misurare i livelli intracellulari di metaboliti non invasivo aiutando nello sviluppo di modelli metabolici e high throughput screening delle condizioni bioprocesso.

Abstract

Nell'era della biologia computazionale, i nuovi sistemi sperimentali ad alto rendimento sono necessarie per compilare e perfezionare i modelli in modo che possano essere convalidati a fini predittivi. Idealmente tali sistemi sarebbero basso volume, che preclude campionamento e analisi distruttive quando i dati del corso tempo si vogliono ottenere. Ciò che occorre è un strumento di monitoraggio in situ che possono comunicare le informazioni necessarie in tempo reale e in maniera non invasiva. Un'opzione interessante è l'uso di fluorescente, sensori biologici in vivo segnalanti concentrazioni intracellulari base di proteine. Una classe particolare di biosensori in vivo che ha trovato applicazioni in metabolita quantificazione si riferiscono al trasferimento Förster Resonance Energy (FRET) tra due proteine ​​fluorescenti collegati da un dominio di legame al ligando. FRET sensori biologici integrati (FIBS) sono costitutivamente prodotte all'interno della linea cellulare, hanno tempi di risposta veloci e il loro cha spettralestiche variare in funzione della concentrazione del metabolita all'interno della cellula. In questo documento, il metodo per la costruzione di ovaio di criceto cinese (CHO) linee cellulari che esprimono costitutivamente un FIBS per il glucosio e glutammina e calibrare le FIBS in vivo in coltura cellulare in batch per consentire futuro quantificazione della concentrazione di metabolita intracellulare è descritto. I dati di fed-batch colture di cellule CHO dimostra che i FIBS è stato in grado in ogni caso a rilevare il conseguente cambiamento della concentrazione intracellulare. Utilizzando il segnale fluorescente dalle FIBS e la curva di taratura precedentemente costruita, la concentrazione intracellulare è stata determinata con precisione come confermato mediante saggio enzimatico indipendente.

Introduction

Monitoraggio metabolita ha varie applicazioni in bioprocessi, compreso lo sviluppo di processo, media e il design dei mangimi, e l'ingegneria metabolica. Vari metodi sono disponibili per le misure di concentrazione attraverso l'uso di ¹ enzimatica, chimico ^2, o saggi di legame ^3. Un'opzione interessante è l'uso di fluorescente, sensori biologici in vivo come reporter della concentrazione intracellulare di metaboliti principali a base di proteine. In saggi ultra-basso volume, fluorescenza è uno strumento utile come miniaturizzazione migliora anche il rapporto ^4,5 segnale-rumore e sensori a base di proteine ​​può essere geneticamente codificato senso che non reagenti esogeni sono necessari per l'analisi metabolita. Trasferimento Förster Resonance Energy (FRET) biosensori costituiti da due proteine ​​fluorescenti collegati da un dominio di legame al ligando. FRET è un trasferimento nonradiative di energia da un donatore foto-eccitati per un accettore fluorescente molecola Locat Ed in prossimità (<100). Ligando clivaggio o vincolante provoca un cambiamento conformazionale nel sensore, che, a sua volta, induce un cambiamento in prossimità dei fluorofori, portando ad un cambiamento di efficienza FRET misurata dalla variazione dello spettro di emissione. Sensori biologici FRET integrati (FIBS) sono costitutivamente prodotte all'interno della linea cellulare e le loro caratteristiche spettrali variare in funzione della concentrazione del metabolita all'interno della cellula. FIBS hanno tempi di risposta veloci che li rende ideali per prendere le misure per i modelli dinamici ^6. Applicazioni precedenti includono il monitoraggio singole ^7-9 e più ^{di 10} metaboliti e fornendo dati sulla distribuzione spazio-temporale ^11. FIBS possono essere creati in due configurazioni: Apo-Max, dove legame del ligando interrompe la vicinanza dei fluorofori abbassamento trasferimento di energia e Apo-Min, dove legame ligando porta i due fluorofori in più stretto contatto (Figura 1).

_content "> In questo lavoro, un protocollo è presentato per la costruzione di ovaio di criceto cinese (CHO) linee cellulari che esprimono costitutivamente un FIBS per un metabolita, glucosio o glutammina. Una metodologia è stabilito per la calibrazione del sensore in vivo per abilitare futuro quantitativa misure di concentrazione metabolita intracellulare, come illustrato nella figura 2. Sulla base di questo, la concentrazione intracellulare di glucosio o glutammina può essere determinato in fed-batch colture di cellule CHO, a cui i due nutrienti sono stati aggiunti in alte concentrazioni in-process. I risultati dimostrano che utilizzando il segnale fluorescente dalle FIBS e la curva di taratura precedentemente costruita, accuratamente previsione della concentrazione intracellulare è possibile, come confermato mediante saggio enzimatico indipendente. Questo metodo offre notevoli vantaggi rispetto alle attuali tecnologie analitiche perché è invasiva, a basso costo e veloce, dando un segnale in tempo reale dei FIBS che possono essere monitored tutta la cultura.

Protocol

1. Cella linea Revival e manutenzione Revive cellule CHO in 9 ml CD-CHO medio integrato con 8 mM L-glutammina e 10 ml / L integratore 100x ipoxantina / timidina (terreno di coltura completo). Centrifugare a 100 xg per 5 min. Risospendere le cellule in 10 ml di fresco mezzo di crescita integrale. Rimuovere un campione di 1 ml e determinare la concentrazione di cellule vitali mediante microscopio ottico utilizzando il metodo esclusione del colorante blu tripano in un emocitometro. …

Representative Results

Una panoramica della metodologia è presentato in Figura 2. Nel lavoro qui presentato, cellule CHO sono state transfettate con il vettore FIBS e linee cellulari stabili sono stati selezionati con una pressione antibiotico di 400 mcg / ml Zeocin. Due linee separate cellulari stabili esprimenti costitutivamente i sensori di glucosio e glutammina sono stati quindi creati. Figura 1 illustra le configurazioni delle due biosensori utilizzati in questo studio. Il sensore di glucosio si basa su…

Discussion

Le FIBS permettono in vivo e in situ quantificazione di molecole chiave, in questo caso nutrienti crescita limitativo, eliminando incertezze derivanti da tempra e metodi di estrazione. I risultati suggeriscono che vi è una buona correlazione tra il segnale FIBS e le concentrazioni intracellulari nell'intervallo 1-5 mM di glucosio e 0,3-2 mM di glutammina. Nel lotto coltura cellulare CHO, queste concentrazioni si incontrano nelle fasi di declino esponenziale, stazionarie, e le prime. Le fasi espone…

Materials

CHO-S Cells	Life Tecnologies	11619-012	Cell line will vary depending on the goals of the study
pCDNA4/TO vector	Life Tecnologies
TransIT-PRO Transfection Reagent	Mirus Bio	MIR 5700	Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study
Zeocin	Invivogen
CD-CHO medium	Life Technologies	10743-011	Cell growth medium is dependent upon the cells under study
100X HT Supplement	Life Technologies	11067-030
L-Glutamine 200 mM (100X), Liquid	Life Technologies	25030032
InfinitePRO 200 plate reader	Tecan	FLx800TBI	Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted
Filters for plate reader	Tecan	30000463
		(520NM BW 10NM)
		30022786
		(430NM BW 35NM)
		30022787
		(465NM BW 35NM)
Maxiprep Plasmid Purification Kit	Qiagen	12163	Any suitable kit can be substituted
Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit	Invitrogen	A22189	Any suitable kit can be substituted
EnzyChrom  Glutamine Assay Kit	BioAssay systems	EOAC-100	Any suitable kit can be substituted
Improved Neubauer haemocytometer	Fisher Scientific	MNK-420-010N
Incubator	Nuaire	NU-5510E