成体マウス切歯から歯科上皮幹細胞の単離および培養
Summary
継続的に成長しているマウスの門歯は、歯科上皮幹細胞（DESCs）から歯の組織の更新を研究するためのモデルを提供します。一貫して確実切歯からこれらの細胞を取得し、in vitroでそれらを拡張するための堅牢なシステムをここで報告されている。
Abstract
歯の再生と刷新の根底にある細胞および分子メカニズムを理解することは、大きな関心1-4の話題になると、マウスの切歯は、これらのプロセスのためのモデルを提供しています。この驚くべき器官は、動物の生涯を通じて継続的に成長し、（舌側）（唇側）唇と舌頚椎ループ（CL）領域内に収容された成体幹細胞のアクティブなプールから必要なすべての細胞型を生成します。唇CLからのみの歯科幹細胞は、唇表面のエナメル質、歯の外側カバーを、生成エナメル芽細胞を生じさせる。この非対称エナメル形成は切歯先端に擦り傷を可能にし、近位の切歯における前駆細胞や幹細胞は歯の組織が常に補充されていることを確認。 試験管内で 、これらの前駆細胞もしくは幹細胞を単離および増殖する能力は、その拡張を可能にし、例えばHなどの生体内では達成できない多くの実験、への扉を開きます潜在的な幹細胞調節因子のIGHスループット·テスト。ここでは記述し、マウスの切歯の唇CLからの培養細胞への信頼性と一貫性のある方法を示す。
Introduction
脊椎動物のユニークな特徴の一つは、歯の進化である。この器官に関連する分子経路及び形態学の専門分野が発達し、進化生物学者5によるものを含む、いくつかの観点から検討されているように歯は、研究の多くの分野のための重要なモデルシステムとなっています。より最近では、再生医療の分野は、モデルとしての歯を使用して貴重な洞察を得るために始めている。特に、歯科用上皮幹細胞の発見は、重要な進歩であった6-13。
すべてのげっ歯類は、その成長のこれらの歯の成体幹細胞制御を研究するためのアクセス可能なモデルシステムを作り、幹細胞によって支えられて継続的に成長している切歯を有する。遺伝系統トレース実験8,9,12,14が続き、1970年代10,11における標識実験は、DESCsは切歯の近位領域に存在することを明らかにした。ステム細胞唇子宮頸ループ（CL）として知られている推定のニッチの外唇側に移動、上の上皮の区画に子孫、およびトランジット増幅（TA）細胞（ 図1）と呼ばれる細胞の集団に貢献しています。具体的には、DESCsは、外エナメル上皮（OEE）に存在し、星状胞体（SR）8,9,14、および内エナメル上皮（IEE）は、細胞周期の限られた数を経て進行してから移動し、TA細胞を生じさせる遠位側切歯の長さ（ 図1）に沿って。マウス切歯で分化エナメル芽細胞は、1日15,16で約350ミクロンの驚くべき割合で切歯に沿って遠位方向に移動し続けています。彼らが移動すると、細胞が成熟したエナメル芽細胞と角質アラト（SI）の細胞に分化する。エナメルマトリックスの全層を堆積した後、エナメル芽細胞の多くは、アポトーシスを受け、残りのセルのサイズが縮小し、エナメル質の成熟を制御する<> 17 SUP。このようなSr等の唇のCLでの他の細胞型の系統は、それほど明確であり、間充織18内および舌のCLでの幹細胞に関するデータのみ出現し始めている。
マウス切歯モデルを使用して、グループの数は、遺伝的経路と自然の幹細胞に基づいた臓器再生に関与する細胞生物学的プロセスを解明するために取り組んできました。しかし、唇CLが困難な初代細胞での作業になり約5000のマウス切歯あたりと推定された細胞の数が比較的少なく、含まれています。そのため、努力が文化に作られ、 生体内で達成可能ではない実験的なアプローチに新たな扉を開くために体外 6,16,19,20 におけるこれらの細胞を拡大してきた。ほとんどの最近の研究は、これらの細胞が両方の自己再生および培養13発現細胞アメロゲニンに分化できることを実証した。ここでは、目のための方法を説明し、実証するマウス唇CLからの細胞のE信頼性と一貫性の文化。
Protocol
Representative Results
Discussion
上皮細胞は、40年以上前に21〜24第一に成功培養し、さらに最近では、上皮幹細胞の正常な分離25〜27は、上皮生物学の知識を進んでいる。我々は、成体マウスの切歯のDESCs、歯の生物学とエナメル質の形成に重要な洞察をもたらす可能性を秘めている幹細胞の比較的代役集団を単離するためのプロトコルを報告している。このプロトコルは、最初は毛包28から上皮幹細?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、DESCの文化と初期支援する秀のping王に感謝します。著者は（ODKにK12-GM081266は、MGCに、K99-DE022059 AHJにK08-DE022377-02 OHに、そしてR01-DE021420）国立衛生研究所からの奨学金や助成金によって部分的に資金を供給している。
Materials
| Forceps, size 5 | Fine Science Tools | 11251-30 | FST by Dumont, Dumoxel, |
| Forceps Straight, fine, 3.5 | Roboz | RS5070 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Services | #71960 | |
| Scalpel Handle No.3 | VWR | ||
| Feather Blade No. 15 | Electron Microscopy Services | #72044-15 | Surgical Stainless Steel |
| Collagenase Type-1 filtered | Worthington Biochemical Corporation | #4214 | |
| Insulin syringe | BD | #329424 | |
| Accumax | EMD Millipore | #SCR006 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | |
| EGF | R&D | 2028-EG-200 | |
| FGF2 | R&D | 233-FB-025 | |
| B27 Supplement | Gibco | 10889-038 |
Referencias
- Sharpe, P. T., Young, C. S. Test-tube teeth.. Sci Am. 293, 34-41 (2005).
- D’Souza, R. N., Klein, O. D. Unraveling the molecular mechanisms that lead to supernumerary teeth in mice and men: Current concepts and novel approaches. Cells Tissues Organs. 186, 60-69 (2007).
- Jernvall, J., Thesleff, I. Tooth shape formation and tooth renewal: evolving with the same signals. Development. 139, 3487-3497 (2012).
- Yen, A. H., Yelick, P. C. Dental Tissue Regeneration A Mini-Review. Gerontology. 57, 85-94 (2011).
- Jheon, A. H., Seidel, K., Biehs, B., Klein, O. D. From molecules to mastication: the development and evolution of tooth development. WIREs Dev Biol. 2, 165-182 (2013).
- Wang, X. P., et al. An integrated gene regulatory network controls stem cell proliferation in teeth. PLoS Biol. 5, (2007).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. J Cell Biol. 147, 105-120 (1999).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Dev Cell. 23, 317-328 (2012).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137, 3753-3761 (2010).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. Anat Rec. 183, 523-561 (1975).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Quantitative analysis of cell turnover in the enamel organ of the rat incisor. Evidence for ameloblast death immediately after enamel matrix secretion. Anat Rec. 187, 63-98 (1977).
- Parsa, S., et al. Signaling by FGFR2b controls the regenerative capacity of adult mouse incisors. Development. 137, 3743-3752 (2010).
- Chang, J. Y., et al. Self-renewal and multilineage differentiation of mouse dental epithelial stem cells. Stem Cell Res. 11, 990-1002 (2013).
- Biehs, B., et al. Bmi1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nat Cell Biol. 15, 846-852 (2013).
- Hwang, W. S., Tonna, E. A. Autoradiographic Analysis of Labeling Indices and Migration Rates of Cellular Component of Mouse Incisors Using Tritiated Thymidine (H3tdr). J Dent Res. 44, 42-53 (1965).
- Li, C. Y., et al. E-cadherin regulates the behavior and fate of epithelial stem cells and their progeny in the mouse incisor. Dev Biol. 366, 357-366 (2012).
- Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Crit Rev Oral Biol Med. 9, 128-161 (1998).
- Lapthanasupkul, P., et al. Ring1a/b polycomb proteins regulate the mesenchymal stem cell niche in continuously growing incisors. Dev Biol. 367, 140-153 (2012).
- Chavez, M. G., et al. Characterization of dental epithelial stem cells from the mouse incisor with two-dimensional and three-dimensional platforms. Tissue Eng Part C Methods. 19, 15-24 (2013).
- Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
- Briggaman, R. A., Abele, D. C., Harris, S. R., Wheeler, C. E. Preparation and characterization of a viable suspension of postembryonic human epidermal cells. J Invest Dermatol. 48, 159-168 (1967).
- Fusenig, N. E. Isolation and cultivation of epidermal cells from embryonic mouse skin. Naturwissenschaften. 58, 421 (1971).
- Fusenig, N. E., Worst, P. K. Mouse epidermal cell cultures. I. Isolation and cultivation of epidermal cells from adult mouse skin. J Invest Dermatol. 63, 187-193 (1974).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
- Barrandon, Y., Green, H. Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 2302-2306 (1987).
- Blanpain, C., et al. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118, 635-648 (2004).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
- Nowak, J. A., Fuchs, E. Isolation and culture of epithelial stem cells. Methods Mol Biol. 482, 215-232 (2009).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Epidermal growth factor and the multiplication of cultured human epidermal keratinocytes. Nature. 265, 421-424 (1977).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Lesuisse, C., Martin, L. J. Long-term culture of mouse cortical neurons as a model for neuronal development, aging, and death. J Neurobiol. 51, 9-23 (2002).
- Felszeghy, S., Suomalainen, M., Thesleff, I. Notch signalling is required for the survival of epithelial stem cells in the continuously growing mouse incisor. Differentiation. 80, 241-248 (2010).
- Fujimori, S., et al. Wnt/beta-catenin signaling in the dental mesenchyme regulates incisor development by regulating Bmp4. Dev Biol. 348, 97-106 (2010).
- Klein, O. D., et al. An FGF signaling loop sustains the generation of differentiated progeny from stem cells in mouse incisors. Development. 135, 377-385 (2008).
