G-protein bağlı reseptörler ile Potasyum kanallarının modülasyonunu Algılama Label içermeyen optik Biyosensör kullanımı
Summary
Optik biosensor teknikleri canlı hücrelerin içindeki plazma zarının hemen yakınındaki kütlesinde değişiklikleri algılar ve bir tek hücre ve hücre popülasyonları hem de hücresel yanıtları takip izin verebilir. Bu protokol, bu yaklaşımı kullanarak sağlam hücrelerdeki G-protein bağlı reseptörler ile potasyum kanallarının modülasyonu algılanmasını anlatacağız.
Abstract
İyon kanalları seçici iyonları, plazma zarının 1 akmasına izin vererek, nöronlar ve diğer uyarılabilir hücre tiplerinin elektrik özelliklerini kontrol eder. Nöronal uyarılabilirliği düzenlemek için, iyon kanallarının biyofiziksel özellikleri çoğu zaman bir heteromerik kompleks kanal 2,3 oluşturmak için kanallar kendilerini bağlayan protein ve sinyal molekülleri tarafından modifiye edilir. Canlı hücrelerde etkileşimler zaman süreci hakkında az bilgi sağlarken kanalları ve düzenleyici proteinleri arasındaki etkileşimi incelemek geleneksel deneyler, potansiyel olarak proteinin davranışını değiştirebilir ve hedefin fizyolojik önemi düşürebilir dışsal etiket gerektirir. Örneğin X-BODY Bıoscıences BIND Tarayıcı sistem olarak optik biyosensörler, rezonans değişiklikleri algılamak için, yeni bir etiket içermeyen teknoloji, rezonans dalga boyu ızgara (RWG) optik biyosensör kullanmak biyosensör yakın ışık yansır. Bu deney sağlar: göreceli algılamahücre yapışmasında ligand bağlı değişiklikler ve yayılma, toksisite, proliferasyon ve plazma zarı yakın protein-protein etkileşimleri değişikliklerden kaynaklanan biyosensör yüzeyine yapışık canlı hücre alt kısmı içinde kütle olarak değiştirin. RWG'nin optik biyosensörler G-protein bağlı reseptörler (GPCR'ler), reseptör tirozin kinazlar ve diğer hücre yüzeyi reseptörlerinin aktivasyonu takiben hücrelerin plazma zarı yakın kütle değişiklikleri tespit etmek için kullanılmıştır. Iyon kanalı-protein etkileşimleri Ligand ile uyarılan değişiklikler de bu tahlil kullanılarak incelenebilir. Bu yazıda, Slack-B sodyum-potasyum aktive GPCRs tarafından (K Na) kanalları modülasyonu algılamak için kullanılan deneysel prosedür anlatacağız.
Introduction
Bunların fizyolojik olarak ilgili bağlamda canlı hücrelerin incelenmesi, hücresel hedefler biyolojik fonksiyonları anlamak için çok önemlidir. Bununla birlikte, kanal ve bu coimmunoprecipitation tahlilleri gibi düzenleyici sitoplazmik proteinler arasındaki etkileşimi incelemek tahliller, genel olarak, canlı hücrelerde etkileşimler zaman süreci ile ilgili çok az bilgi sağlar. Mevcut hücre bazlı deneylerde büyük bir çoğunluğu bu ilgi bir floresan etiketli proteinin translokasyon gibi belirli bir hücresel etkinlik, ölçün. Bu deneyler, potansiyel proteinin davranışını değiştirebilir ve hedefin fizyolojik önemi azaltabilir, ilgi konusu proteinlerin modifikasyonları gerektirir. , Sistemin işleme gerektiren hücresel aktivite sürekli bir ölçümünü sağlar ve en uygun durumda fizyolojik olarak 4 hücre çalışmaları izin vermez invaziv olmayan hücre bazlı deneyler,.
Optik biyosensörler üretmek için tasarlanmıştırsensör yüzeyine birleştirilmiş olan bir ışık karakteristik bir değişiklik ölçülebilir. Yüzey plazmon rezonansı (SPR) ile rezonans dalgaboyu ızgara (RWG) teknikler kaybolan dalgalar kullanan optik biyosensörler, öncelikle sensör yüzeyi üzerinde hareketsizleştirilmiş biyolojik reseptörlerine bağlanma moleküllerinin afinite ve kinetik tespit etmek için kullanılmıştır. Daha yakın zamanda, ticari olarak temin edilebilir RWG biyosensörler yüksek uzamsal çözünürlük (en fazla 3.75 mikron / piksel) 5 de sensor yüzeyine yapışık hücre alt kısmı içinde kütlesindeki nispi değişimin saptanmasına olanak tanınması için geliştirilmiştir. Bu biyosensörler, hücre yapışması ve yayılması, toksisite, çoğalması ve G-protein bağlı reseptörler (GPCR'ler) de dahil olmak üzere hücre yüzeyi reseptörlerinin çeşitli tarafından ortaya çıkarılan sinyal yollarının olarak uyarılması sonucu canlı hücreler, plazma zarı yakın kütle değişiklikleri saptayabilir 6 . İÇG biyosensörler göreli chan tespitbiyosensör 7, 150 nm olan kütlesindeki nispi değişimin bir fonksiyonu olarak kırılma endeksi ge. Hücreler biyosensör için kaplama zaman, kırılma endeksi, bu değişiklik, biyosensör için hücresel yapışma içinde değişimden ortaya çıkan hücrenin plazma zarının yakın kütle değişimi yansıtır. Bu protokol RWG'nin biyosensörler kullanarak kanal-protein etkileşimlerinin algılama tartışılacaktır.
RWG'nin veri toplama sistemleri birçok bileşenden oluşur. X-BODY Bıoscıences BIND Tarayıcı Bu deneyler için kullanılan Çünkü, biz bir plaka okuyucu, ilişkili biyosensör, BIND Tarama toplama yazılımı ve BIND Görünüm analiz yazılımı 8 oluşan bu özel sistem için bileşenleri ifade eder. Fotonik kristal biyosensörler, optik biyosensörler değinilmektedir, bir periyodik düzenlemesi oluşan belirli bir ışığın ilerlemesini önler 2 ya da 3 boyutlu olarak ve dielektrik malzemedalga boyları ve yönleri. Fotonik kristal yapılar Wood'un anomali denilen bir olgu dayanmaktadır. İlk olarak 1902 yılında Wood tarafından keşfedilen, anormallikler, özellikle kırılma siparişinin yoğunluğunda hızlı değişimler belirli dar bir frekans bantlarında meydana optik kırılma ızgarası ile yansıtılan ışığın spektrumunda gözlenen etkileri vardır. 1962 yılında, Hessel ve Oliner sonlu dönemi ızgara ayakta rezonans dalga boyu 9 oluşturduğu, Wood'un anomalilerin yeni bir teori sundu. Burada tarif edilmiş olan optik biyosensör olarak, Wood anomalileri beyaz ışık ile uyarıldığında dalga boyu, sadece çok dar bir bant (tipik olarak 850-855 nm) yansıttığı bir RWG'nin biyosensör üretmek için kullanılır.
Bireysel biyosensörler yüksek kırılma dielektrik malzemesi titanyum dioksit (TiO 2) ince bir tabaka ile kaplanmış olan bir periyodik bir yüzey yapısına sahip, düşük kırılma indeksli bir plastik malzemeden oluşur. Ne biosensveya Fotonik kristallerin optik ızgara BIND Tarayıcı bir spektrofotometre ile ölçülür ışığın dalga boyu dar bir aralık yansıtan geniş bir dalga boyu ışık kaynağı ile aydınlatılır. Yansıyan dalga boyunda (tepe değer Dalga boyu veya PWV) zirve yoğunluğu daha sonra sinyalden hesaplanır. Biosensor yüzeyin yakınlık içinde kütlesinde bir artış veya azalma (~ 150 nm) bir sonucu olarak kırılma indisindeki bir değişiklik, üzerine hafif kaymaların PWV. Optik biyosensörler Biyomoleküler Sciences için standart Derneği (SBS), bu deneylerde kullanılan deneyleri için 384 oyuklu mikro-plaka içine dahil edilmiştir.
RWV biyosensörler hücreleri 10 oturma eksojen sinyallerinin eklenmesi üzerine değişiklikleri tespit etmek için kullanılır. Hücreler doğrudan RWG'nin biyosensör yüzeyi üzerine kültürlenir ve kırılma yerel endeksinin değişimi belli bir uyarana ile işlenmesi üzerine izlenir. Biosensör kütle değişikliği yön olabilirYerel biosensör yakın kütlesinde bir artış kırılma endeksi ve sonuç olarak bir artış PWV bir artış olarak ölçülür, çünkü belirlenmiştir. Tersine kütlesinde bir azalma PWV bir düşüş üretir. Tespit PWV değişiklik hücre yapışması değişiklikler, protein işe / serbest bırakılması, endositoz ve geri dönüşüm, ekzositoz, apoptoz ve hücre iskeleti yeniden düzenlenmesi de dahil olmak üzere çok sayıda hücresel olaylar, neden olabilir. Örneğin, tahlil, potasyum kanallarını ve diğer sitoplazmik ya da hücre iskelet yapısı arasında kanal-protein etkileşimleri değişiklikleri tespit edilebilir. Olay, ancak, biosensör yakın ~ 150 nm saptama bölgesi içinde meydana gelir ve plazma zarı yakın bağlı bir hücrenin, söz konusu olmalıdır. Hücresel tepkilerin kazanılması BIND Scan yazılımı ile gerçekleştirilir ve SBS levhadaki 384 kuyu her bir görüntü gösterimi oluşturulur. Bu sistem tek bir hücre içinde olayların tespitine olanak sağlayan, en fazla 3.75 mm / piksel çözünürlüğe sahip ve(örneğin, HEK293 ya da CHO hücreleri gibi) hücre hatları ile birlikte ya da daha fazla fizyolojik olarak uygun primer ya da hücreleri ile kullanılabilir. BIND görüntüle, yazılımı ile görüntü analizi ve bireysel hücre popülasyonları hem de hücresel yanıtları saptanmasını sağlar. Biyosensörler mikro 384 oyuklu standart SBS dahil edilir olarak, sistem, yüksek verimli tarama (HTS) için kolayca uyarlanabilir.
Rezonans-dalga boyu ızgara optik biyosensörler önce GPCRs 11 aktivasyonu, aşağıdaki hücrelerin plazma zarı yakın kütle değişiklikleri tespit etmek için kullanılmıştır. Bizim laboratuvar iki sodyum-aktif (K Na) potasyum kanalları, Slack-B ve Slick 12 klonlanmış oldu. Her iki B-Fren ve kaygan kanallarının aktivitesi çok güçlü bir protein kinaz C (PKC) aktivasyonu 13 doğrudan etkilenmiş olduğu gösterilmiştir. Bu tür muskarinik M1 reseptör ve mGluR1 metabotropik glutamat olarak R Gα q protein bağlı reseptörler, aktivasyonuçifti donörlüğü, kuvvetli PKC aktivasyonu yoluyla kanal aktivitesini düzenler. Bu K, Na kanal tutmalı uyarılması esnasında nöronal uyum katkı ve eylem zamanlama hassasiyeti 14 potansiyeller düzenler. Slack kanalları FMRP, Fragile X Zihinsel Engelliler protein 15,16 dahil sitoplazmik sinyal molekülleri, çeşitli etkileşim bilinmektedir. Bebeklik (MMPSI), ağır gelişme geriliği 17 sonuçları epilepsi erken başlangıçlı formu Çoklu Geçiş Kısmi Yakalanan Gevşek sonucu mutasyonlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Z ana (Z ') faktör yüksek verimli bir tarama deneyinde 20 kalitesini ölçmek için yaygın istatistiksel bir yöntemdir, ve bu tahlilde GPCR agonistlerinin tarama bir SBS uyumlu bir 384 tahlilinde oluştuğu için, mükemmel bir sağlar Bu deneyde 21 sağlamlık ve geçerlilik ölçüsü. 1 AZ 'değeri varolmayan standart sapmalar ile veri noktaları sonsuz sayıda bir teorik ideal bir tahlil gösterir. 0.5 'in altında bir marjinal bilgi deney dikkate ile 0,5-1 arasında bulunan AZ&…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar stabil sıçan Slack-B proteini ifade HEK293 hücrelerin cömert bağış için Yale Üniversitesi'nden Dr Fred Sigworth laboratuvarında Dr Yangyang Yan minnettarız. Ayrıca yazarlar Video tanıtımı görüntülenen Slack kriyo-elektron mikroskopisi homoloji modeli için Dr Sigworth minnettarız. Bu araştırma LKK NIH Hibe DH067517 ve NS073943 tarafından desteklenmiştir
Materials
| DMEM, High Glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Geneticin G-418 Sulfate | American Bioanalytical | AB05057 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-092 | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5378 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | |
| Carbamoylcholine chloride | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt | Sigma-Aldrich | S8701 | |
| Finnpipette (5-50 µl) | Thermo Scientific | 4662090 | |
| BIND Scanner System | X-BODY Biosciences | N/A | |
| 384-well TiO2 coated plates | X-BODY Biosciences | TiO-96-CM |
Referencias
- Hille, B. . Ion Channels of Excitable Membranes. , (1992).
- Kaczmarek, L. K. Non-conducting functions of voltage-gated ion channels. Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).
- Levitan, I. B. Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels. Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).
- Shamah, S. M., Cunningham, B. T. Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors. Analyst. 136, 1090-1102 (2011).
- Cunningham, B. T., Laing, L. M. i. c. r. o. p. l. a. t. e. -. b. a. s. e. d. label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics. Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).
- Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays. Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).
- Cunningham, B. T., et al. Label-free assays on the BIND system. J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).
- Hessel, A. a. O., A, A. A New Theory of Wood’s Anomalies on Optical Gratings. Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).
- Cunningham, B. T., Laing, L. G. Advantages and application of label-free detection assays in drug screening. Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).
- Lee, P. H. Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).
- Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. For K+ channels, Na+ is the new Ca2. Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).
- Santi, C. M., et al. Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators. J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).
- Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons. J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).
- Brown, M. R., et al. Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel. 13, 819-821 (2010).
- Zhang, Y., et al. Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels. J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).
- Barcia, G., et al. De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy. Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).
- Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).
- Nelson, C. D., et al. Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins. Science. 315, 663-666 (2007).
- Zhang, J. H. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Gribbon, P., et al. Evaluating real-life high-throughput screening data. J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).
