Drie dimensionaal culturen: Een hulpmiddel om te studeren Normaal Acinaire Architectuur versus maligne transformatie van cellen borst
Summary
Drie dimensionale cultuur van mammaire epitheelcellen op een gereconstitueerde basaalmembraan is een handige methode om de in vivo architectuur van de goedaardige borst herhalen, en het maligne fenotype onderscheiden van goedaardige borst fenotype. Belangrijk is dat dit systeem worden toegepast invasieve carcinomen studie in weefsels.
Abstract
Invasieve borstkankers zijn een groep van kwaadaardige epitheliale tumoren worden gekenmerkt door de invasie van aangrenzende weefsels en neiging tot metastaseren. Het samenspel van signalen tussen kankercellen en hun micro-omgeving oefent een krachtige invloed op de groei van borstkanker en biologisch gedrag 1. De meeste van deze signalen uit de extracellulaire matrix verloren of hun relevantie onderbestudeerd wanneer cellen worden gekweekt in cultuur tweedimensionale (2D) als een monolaag. De laatste jaren heeft driedimensionale (3D) kweek op een gereconstitueerde basaalmembraan voren gekomen als een voorkeurswerkwijze voor de weefselarchitectuur van goedaardige en kwaadaardige borstcellen recapituleren. Cellen gekweekt in 3D behoudt de belangrijkste signalen van de extracellulaire matrix en een fysiologisch relevante ex vivo systeem 2,3. Van de nota, is er steeds meer aanwijzingen dat de cellen zich anders gedragen wanneer ze groeien in 3D in vergelijking met 2D 4. 3D cultuureffectief kan worden gebruikt als middel om het kwaadaardige fenotype onderscheiden van goedaardige borst fenotype en onderbouwing van de cellulaire en moleculaire signalering betrokken 3. Een van de onderscheidende kenmerken van goedaardige epitheliale cellen is dat ze gepoold zodat de apicale cytoplasma naar het lumen en de basale cytoplasma rust op het basale membraan. Dit apico-basale polariteit verloren invasieve borstkankers, die worden gekenmerkt door cellulaire desorganisatie en vorming van anastomose en vertakkende buisjes die willekeurig infiltreert de omliggende stroma. Deze histopathologische verschillen tussen goedaardige klier en invasief carcinoom kan worden gereproduceerd in 3D 6,7. Met de juiste uitlezingen zoals de kwantificering van ronde acinaire structuren of differentiële expressie van gevalideerde moleculaire markers voor celproliferatie, polariteit en apoptose in combinatie met andere moleculaire en celbiologie technieken, 3D cule kan een belangrijk instrument om beter inzicht in de cellulaire veranderingen tijdens maligne transformatie en voor de afbakening van de verantwoorde signalering te bieden.
Introduction
Driedimensionale cultuur (3D) van borst epitheelcellen op gereconstitueerde basale membraan is een belangrijk modelsysteem om de complexe fenotype en de bijbehorende signalering van normale borst en borstkanker 2,3 bestuderen. De functionele eenheid van borst is de terminal kanaal lobulaire eenheid (TDLU) die bestaat uit een kleine buis die zich vertakt in acini. De acini zijn zeer georganiseerde structuren, bestaande uit twee cellagen, epitheliale en myo cellen, die worden omgeven door een basale membraan 5. De meest onderscheidende kenmerken van normale acini zijn cellulaire polarisatie, bevestiging aan de onderliggende basale membraan en gespecialiseerde cel-cel contacten. Dit ingewikkelde organisatie is verstoord bij invasieve carcinomen. De gebruikte 2D culturen, waarbij cellen worden gekweekt als monolagen, niet mogelijk de vorming van acini. Aldus wordt de monolaagkweek ontbreekt verschaffen van een systeem om de complexe relatie tussen epitheelcellen vangenin normale borst en de deregulering bij borstkanker. Functionele monotypisch epitheliale culturen van borstcellen ontwikkeld in verschillende laboratoria 2,3. 3D cultuur behelst de groei van borstkanker cellen op Matrigel, een oplosbaar extract uit Engelbreth-Holm-Swarm muizen sarcoma cellen en is commercieel verkrijgbaar. Andere 3D substraten zoals collageen I worden gebruikt. De borst cellen kunnen in 3D worden gekweekt door 3D ingebed assay, waarbij cellen gekweekt ingebed in Matrigel 2. Als alternatief kunnen de cellen worden gekweekt door 3D bovenop test, ook wel 3D-overlay-test, die is kosteneffectief als het vereist minder volume van Matrigel, en vergemakkelijkt time lapse monitoring van de kolonie de vorming van fase contrast beeldvorming en is ideaal voor in situ imaging 2 -3. De 3D bovenaan assay werd gebruikt om de correlatie tussen de acinaire fenotype en genexpressieprofiel 7 definiëren.
3D cultuur kan worden effectivEly gebruikt om normale en goedaardige cellen onderscheiden van invasief carcinoom. Normale en goedaardige borst cellen vormen groei gearresteerd gepolariseerde structuren met een goed gedefinieerde lumen in het centrum op Matrigel terwijl invasief carcinoom cellen groeien overvloedig en lukraak, zonder verrekening van het lumen. E6/E7 onsterfelijke, menselijke borstklieren epitheliale cellen en MCF10A cellijn, dat is een spontaan vereeuwigd cellijn geïsoleerd uit een 36-jarige patiënt met fibrocystische veranderingen, zijn met succes gebruikt om de goedaardige borst fenotype heroveren in 3D 3,8 en hebben gediend als een modelsysteem voor de oncogene en tumor suppressor functie van verschillende moleculen 8,9 bestuderen. Deze goedaardige cellen kunnen worden ontworpen om gen (en) plaats manipuleren door introductie van lentivirus / retrovirus. Als het gen (en) van belang is een tumor suppressor, zal shRNA gemedieerde knockdown leiden tot een maligne transformatie terwijl als het betreffende gen is een oncogen overexpressie in goedaardige cellenmoet een maligne fenotype. In beide gevallen is de acinar structuren gevormd in 3D kan het maligne transformatie vast te leggen.
Goedaardige enkele cellen uitgeplaat in 3D beginnen te groeien en vormen ronde bolvormige structuren. Overdag 5-8 deze bolvormige aggregaat van cellen differentiëren in een omringende gepolariseerde laag van cellen die in contact met de Matrigel, en een binnenste massa van minder gepolariseerde cellen, die contact met de Matrigel ontbreekt. In de komende 10-15 dagen zal de binnenste cellen beginnen te sterven door apoptose het vormen van een duidelijk lumen. De kwaadaardige cellen groeien lukraak verlies van hun polariteit. Zeer kwaadaardige cellen vormen meestal vertakkende structuren. Deze verschillen in fenotype kan worden opgevangen door tijdsverloop fase contrast beeldvorming en door in situ immuunkleuring met relevante moleculaire merkers. De meest gebruikte merkers zijn alfa 6-integrine, een basale polariteit marker, in combinatie met de proliferatie merker fosfo-histon 3 en apoptotic marker gekloofd caspase-3. Dit laatste is belangrijk om te bepalen of er lumen formatie in het midden van de acini, een kenmerk van normale en goedaardige borstcellen. Andere polariteit en cel-cel contact merkers omvatten GM130, laminin, ERM, E-cadherine. Afwisselend borstkanker cellijnen kunnen worden ontworpen om het gen van belang te manipuleren. In dit geval terugkeer tot een groei opgepakt kunnen goedaardig fenotype worden gebruikt als een uitgelezen te onderscheiden van het kankerfenotype.
3D cultuur kan zorgvuldig worden gebruikt om de signalerende wegen betrokken bij maligne transformatie 10-11 bakenen. Met behulp van bovenstaande uitlezingen, farmacologische remmers blokkerende antilichamen of recombinante eiwitten kunnen gebruikt worden wijzen op moleculair signalering leidt tot maligne transformatie. Met voortdurende inspanning van verschillende laboratoria is het mogelijk om de cellen extraheren van 3D RNA isoleren en ook lysaten voorbereiden immunoblotting en immunoprecipitation. Deze strategieën zijn beschreven stapsgewijs en gedetailleerd in het protocol.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben hier beschreven driedimensionale kweek van borst epitheelcellen op een gereconstitueerde basaalmembraan en de bruikbaarheid van dit systeem te maken tussen kwaadaardige tegen goedaardige borst fenotype. Dit systeem kan ook worden gebruikt voor cultuur verschillende celtypen van andere klieren weefsels en is gemeld zijn met succes gebruikt om cultuur prostaat epitheliale, bronchiale epitheel en schildklier epitheelcellen, een paar te noemen 12-14. Het belang van 3D cultuur ligt in het feit dat het ee…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie R01 CA107469, R01 CA125577 en U01CA154224 CG Kleer, de Universiteit van het Centrum van Kanker Ondersteuning van Michigan.
Materials
| Growth Factor Reduced matrigel | BD biosciences | 354230 | Avoid repeat freeze thaw |
| Lab-Tek glass hamber slides 8-well | Thermo Fisher Scientific | 177402 | Precool on ice |
| Lab-Tek glass chamber slides 2- well | Thermo Fisher Scientific | 177380 | Precool on ice |
| goat anti mouse F(ab´)2 fragment | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Fluorescent conjugated Alexa antibodies | Molecular probes | Please look at molecular probes website | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Molecular Probes | P36935 | |
| 3D Culture Cell Harvesting kit | Trevigen | 3448-020-k | |
| Anti-Apha-6-integrin | Fisher Scientifics | MAB1378 | 1:00 dilution for IF |
| Anti-GM130 | BD Biosciences | 610822 | 1:00 dilution for IF |
| Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated | Fisher Scientifics | 16-222 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) | Cell Signaling | 9661s | 1:50 dilution for IF |
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | 1:200 dilution for IF |
Referencias
- Arendt, L. M., Rudnick, J. A., Keller, P. J., Kuperwasser, C. Stroma in breast development and disease. Semin. Cell Dev. Biol. 21, 11-18 (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-828 (2010).
- Rosen, P. P., Rosen, P. . Rosen’s breast pathology. , (2008).
- Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem. Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
- Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
- Pal, A., Huang, W., Li, X., Toy, K. A., Nikolovska-Coleska, Z., Kleer, C. G. CCN6 modulates BMP signaling via the Smad-independent TAK1/p38 pathway, acting to suppress metastasis of breast cancer. Cancer Res. 15, 4818-4828 (2012).
- Pal, A., Huang, W., Toy, K. A., Kleer, C. G. CCN6 knockdown disrupts acinar organization of breast cells in three-dimensional cultures through up-regulation of type III TGF-β receptor. Neoplasia. 14, 1067-1074 (2012).
- Wang, F., et al. Phenotypic reversion or death of cancer cells by altering signaling pathways in three-dimensional contexts. J. Natl. Cancer Inst. 94, 1494-1503 (2002).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Wang, R., et al. Three-dimensional co-culture models to study prostate cancer growth, progression, and metastasis to bone. Semin. Cancer Biol. 15, 353-364 (2005).
- Vaughan, M. B., Ramirez, R. D., Wright, W. E., Minna, J. D., Shay, J. W. A three-dimensional model of differentiation of immortalized human bronchial epithelial cells. Differentiation. 74, 141-148 (2006).
- Fata, J. E., Werb, Z., Bissell, M. J. Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes. Breast Cancer Res. 6, 1-11 (2004).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8, 1-11 (2013).
