Consensus Brain-afgeleide eiwit, Extraction Protocol voor de studie van mensen en muizen Brain Proteome behulp Zowel 2D-DIGE en Mini 2DE Immunoblotting
Summary
Een gemeenschappelijke eiwitextractie protocol met behulp van ureum / thioureum / SDS buffer voor menselijke en muizen hersenweefsel maakt het identificeren van eiwitten door 2D-DIGE en de daaropvolgende karakterisering door mini 2DE immunoblotting. Deze methode maakt een meer reproduceerbare en betrouwbare resultaten te verkrijgen van menselijke biopsies en experimentele modellen.
Abstract
Tweedimensionale gelelektroforese (2DE) is een krachtig hulpmiddel om proteoom veranderingen mogelijk gerelateerd aan verschillende fysiologische of pathologische omstandigheden duidelijk worden. In principe is deze techniek gebaseerd op de scheiding van eiwitten op basis van hun iso-elektrisch punt in een eerste stap, en anderzijds naar hun molecuulgewichten door SDS polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE). In dit rapport wordt een geoptimaliseerd monstervoorbereiding protocol voor kleine hoeveelheid menselijke post-mortem en muis hersenweefsel wordt beschreven. Deze methode maakt het mogelijk om zowel tweedimensionale fluorescentie verschil gelelektroforese (2D-DIGE) en mini 2DE immunoblotting voeren. De combinatie van deze benaderingen kan men niet alleen nieuwe eiwitten en / of eiwitmodificaties voorbeeld in hun expressie door de compatibiliteit met massaspectrometrische detectie, maar ook een nieuw inzicht in markers validatie. Zo, mini-2DE gekoppeld aan western blotting vergunningen om bericht te identificeren en te valideren-Translationele modificaties, eiwitten katabolisme en geeft een kwalitatieve vergelijking tussen verschillende omstandigheden en / of behandelingen. Hierin geven we een methode om onderdelen van eiwitcomplexen gevonden in AD en Lewy body dementie, zoals de amyloïd-beta peptide en de alfa-synucleïne bestuderen. De werkwijze kan dus worden aangepast voor de analyse van het proteoom en onoplosbare eiwitten extraheren uit menselijk hersenweefsel en muismodellen ook. Tegelijkertijd kan het nuttige informatie voor de studie van moleculaire en cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij neurodegeneratieve ziekten als potentiële nieuwe biomerkers en therapeutische targets.
Introduction
Psychische en neurologische aandoeningen vertegenwoordigen 13% van de wereldwijde ziektelast, moet nieuwe uitdagingen zoals pathofysiologische mechanismen, risicofactoren en prodromale biomarkers worden onderzocht 1. In lijn met deze doelstelling, proteomics studies van het menselijk brein onmisbaar geworden moleculaire pathways betrokken bij processen zoals geheugen, gedrag, emoties en neuronale plasticiteit bijvoorbeeld, niet alleen voor de fysiologische, maar ook voor pathologische omstandigheden duidelijk worden. Daarom is het gebruik van diermodellen en meer specifiek de transgene muizen, brengt een groot aantal mogelijkheden om de etiologie van humane neurodegeneratieve aandoeningen 2 nabootsen.
Proteomics benaderingen zijn tegenwoordig beschikbaar om deze nieuwe perspectieven te bereiken op het gebied neurowetenschappen. Tweedimensionale gelelektroforese (2DE) is een krachtige en waarschijnlijke eenvoudige methode waarmee vergelijken het proteoom van een groot aantal monsters. Bovendien is ook eenkrachtige methode om een isolaat uit een complex mengsel te identificeren en verder geanalyseerd door massaspectrometrie. Deze techniek bestaat in hoofdzaak in twee opeenvolgende stappen: 1) eiwit gescheiden volgens hun iso-elektrisch punt (pI) van isoelectrofocusing (IEF). Meer bepaald wordt een elektrische potentiaal aangebracht over de Immobiline acrylamide strips onder een pH-gradiënt en dan eiwitten zal migreren en zich richten op een bepaalde pI in functie van de globale netto-lading. 2) Isoelectrically gericht eiwitten denatureren en negatief geladen door toevoeging van natriumdodecylsulfaat (SDS), waardoor eiwitten in de eerste structuur gescheiden afhankelijk van hun schijnbaar molecuulgewicht (MW) van SDS-PAGE 3. Deze twee verschillende eigenschappen kunnen we een dubbele waarde aan in de studie van het proteoom verder gaan aanpakken. Enerzijds Deze benadering biedt de mogelijkheid om een kwantitatieve analyse uit te voeren met minimale kleurstoffen 2D-DIGE methode en anderzijds een qualitative analyse door mini-2DE gekoppeld aan western blotting.
Kwantitatieve analyse van 2D-DIGE schenkt eiwit expressie verandert over de hele steekproef proteoom. In het kort worden monsters gelabeld met drie cyaninen (Cy2, Cy3 en Cy5) emitteert bij drie verschillende golflengten (blauw, groen en rood). Deze fluor minimale kleurstoffen die N-hydroxy-succinimidyl ester groep reageren met de ε-aminogroep van lysines residuen van eiwitten waardoor covalente amide bindingen 4. Lysineresiduen zijn gelabeld slechts tussen de 1-3% en dus meerdere labels toevoeging per eiwit en grote netto lading wijzigingen 5, 6 voorkomen. Cy3 en Cy5 worden vaak gebruikt om twee onafhankelijke steekproeven benoemen terwijl Cy2 labels een mengeling van gelijke delen van de monsters te vergelijken. De twee belangrijkste voordelen zijn dat alle gelabelde monsters zijn gemengd en IEF en SDS-PAGE worden uitgevoerd in een gel uitgevoerd in een keer voor elke stap, het vermijden van de inter variabiliteit onder experimenten te wijten aan vergelijking gels. Bovendien presenteert een hoge detectiegrens van circa 1 femtomole eiwit 7. Gels worden gescand en 2D software vergelijkt het 2D gel fluorescentie afbeeldingen waar Cy2 dient als interne standaard ter identificatie van statistische verschillen tussen de plaatsen voor de achterste identificatie door massaspectrometrie. De 2D analyse software met de interne standaard bereikt een snelle detectie van minder dan 10% verschillen tussen monsters met meer dan 95% van statistische betrouwbaarheid 8.
Kwalitatieve analyse door mini-2DE is een cruciale stap voor eiwitkarakterisering. Het principe is hetzelfde als eerder beschreven voor pI en MW scheiding, maar in dit geval eiwitten die door een kleine polyacrylamidegel naar een membraan en immunoblotting wordt daarna uitgevoerd. Terwijl een dimensie gelelektroforese bepaald veranderingen in eiwitexpressie voor een of meer eiwitten epitopen in functie van het antilichaam, de informatin van mini-2DE begiftigt met twee extra parameters. Ten eerste, het eiwit isovariants veranderen in functie van de PI, wat aangeeft dat post-translationele modificaties zou kunnen plaatsvinden. Ten tweede mag de massa van identificatie spectrometrie indicatief plausibele zymogenen en katabole producten van eiwitten. Daarom wijzigingen waargenomen door 2D-DIGE zijn waarschijnlijk een aanwijzing voor de mechanismen die ten grondslag liggen aan veranderingen in de wereldwijde proteoom profiel. De aanpassing van het immunoblots tussen verschillende monsters voor hetzelfde eiwit epitoop / s door mini-2DE kan zuurgraad veranderingen die licht werpen in post-translationele variaties iets waargenomen of zelfs niet door monodimensional immunoblotten 9, 10 weerspiegelen. Bovendien, deze analyse informeert over de mogelijke splitsingsplaatsen vanwege de kennis van de pI en MW van de metabolische residuen 11,12.
De combinatie van deze twee technieken biedt een aanvullende proteomics analyse. Aan de ene kant 2D-DIGE biedt een type verschillen waardoor een nauwkeurige isolatie van polypeptiden waarvan de expressie is anders. Deze verschillen bestaan in hoofdzaak in het uiterlijk of de verdwijning van een plek of toename / afname van de intensiteit van een gegeven een door software analyse van de tl-gels. Deze vaststellingen zelf waarschijnlijk niet de aard van de wijziging waargenomen verklaren. Daarom, wanneer het polypeptide wordt geïsoleerd en geïdentificeerd door massaspectrometrie, het gebruik van mini-2DE kunnen precies bevestiging 1) de identiteit van het eiwit geïsoleerd en 2) de aard van de verschil verandering in de isovariant / isovorm niveau expressie, post-translationele modificaties en splitsing werkwijzen bijvoorbeeld. Het is echter noodzakelijk om een conferentie lysisbuffer beide geschikt voor 2D-DIGE en mini-2DE om mogelijke dispersies door het gebruik van extractie protocollen die zeer verschillend beperken ontwikkelen.
In dit artikel, we Debeschreven een aangepast protocol voor de voorbereiding, de winning en de prestaties van 2D-DIGE en mini-2DE technieken voor de hersenen eiwitten afkomstig van mens en muis weefsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het ontdekken van pathologische expressie veranderingen van eiwitten, zoektocht naar biomarkers en de modulatie van mogelijke pistes voor farmacologische doelwitten behoren tot de doelstellingen van de Neuroproteomics benadert 30. Temidden van de opkomende instrumenten, het veld 2DE voegt een veelbelovende afwachtend. Niettemin moet een consensus om variabiliteit te minimaliseren en verhoging reproduceerbaarheid in de experimenten worden bereikt. In het verlengde van dit idee een gestandaardiseerd protocol om…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door Inserm, Universiteit van Lille 2, MEDIALZ, Labex (uitmuntendheid laboratorium, programma investeren voor de toekomst) en DISTALZ (ontwikkeling van innovatieve strategieën voor een transdisciplinaire benadering van de ziekte van Alzheimer). FJ.FG is momenteel een ontvanger gemeenschap van ANR (Franse Nationale Research Agency / NeuroSplice de Tau Projet ANR-2010-BLAN-1114 01), maar dit werk ook onder de steun van een subsidie van de JCCM (Spanje).
Materials
| CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5nmol 1 * 5 Nmo | GE Healtcare | 25-8010-65 | |
| Immobiline DryStrip | GE Healtcare | Reference in function of the pH interval/size | |
| IPG Buffer, pH X-X | GE Healtcare | Reference in function of the pH interval desired | |
| AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1 | GE Healtcare | 551797N | |
| DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l | GE Healtcare | 17-1335-01 | |
| KIT BOX IPG 1 * 1 KIT | GE Healtcare | 28-9334-92 | Plastic box to make the passive rehydration |
| MILLEX GS Filter | Millipore | SLGS033SB | |
| Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L) | Bio-Rad | Reference in function of the MW to separate | |
| IPGphor III Isoelectric Focusing Unit | GE Healtcare | 11-0033-64 | |
| Ettan DALTsix Large Electrophoresis System | GE Healtcare | 80-6485-08 | |
| OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm | Gel Company | P2D1.5 |
Referencias
- Collins, P. Y., et al. Grand challenges in global mental health. Nature. 475, 27-30 (2011).
- De Deyn, P. P., Van Dam, D., Sergeant, N., Buée, L. . Animal Models of Dementia Vol. 48 Neuromethods 449-468. , 449-468 (2011).
- O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem. 250, 4007-4021 (1975).
- Riederer, B. M. Non-covalent and covalent protein labeling in two-dimensional gel electrophoresis. J Proteomics. 71, 231-244 (2008).
- Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382, 669-678 (2005).
- Westermeier, R., Scheibe, B. Difference gel electrophoresis based on lys/cys tagging. Methods Mol Biol. 424, 73-85 (2008).
- Gong, L., et al. Drosophila ventral furrow morphogenesis: a proteomic analysis. Development. 131, 643-656 (2004).
- Gharbi, S., et al. Evaluation of two-dimensional differential gel electrophoresis for proteomic expression analysis of a model breast cancer cell system. Mol Cell Proteomics. 1, 91-98 (2002).
- Ando, K., et al. Tau pathology modulates Pin1 post-translational modifications and may be relevant as biomarker. Neurobiol Aging. 34, 757-769 (2013).
- Bretteville, A., et al. Two-dimensional electrophoresis of tau mutants reveals specific phosphorylation pattern likely linked to early tau conformational changes. PLoS One. 4, 4843 (2009).
- Sergeant, N., et al. Two-dimensional characterization of paired helical filament-tau from Alzheimer’s disease: demonstration of an additional 74-kDa component and age-related biochemical modifications. J Neurochem. 69, 834-844 (1997).
- Sergeant, N., et al. Different distribution of phosphorylated tau protein isoforms in Alzheimer’s and Pick’s diseases. FEBS Lett. 412, 578-582 (1997).
- Rabilloud, T., Luche, S., Santoni, V., Chevallet, M. Detergents and chaotropes for protein solubilization before two-dimensional electrophoresis. Methods Mol Biol. 355, 111-119 (2007).
- Wrobel, K., Caruso, J. A. Pretreatment procedures for characterization of arsenic and selenium species in complex samples utilizing coupled techniques with mass spectrometric detection. Anal Bioanal Chem. 381, 317-331 (2005).
- McCarthy, J., et al. Carbamylation of proteins in 2-D electrophoresis–myth or reality. J Proteome Res. 2, 239-242 (2003).
- Chafey, P., et al. Proteomic analysis of beta-catenin activation in mouse liver by DIGE analysis identifies glucose metabolism as a new target of the Wnt pathway. Proteomics. 9, 3889-3900 (2009).
- Kahn, J. E., et al. Comparative proteomic analysis of blood eosinophils reveals redox signaling modifications in patients with FIP1L1-PDGFRA-associated chronic eosinophilic leukemia. J Proteome Res. 10, 1468-1480 (2011).
- Pottiez, G., et al. A large-scale electrophoresis- and chromatography-based determination of gene expression profiles in bovine brain capillary endothelial cells after the re-induction of blood-brain barrier properties. Proteome Sci. 8, 57 (2010).
- Stochaj, W. R., Berkelman, T., Laird, N. Preparative 2D Gel Electrophoresis with Immobilized pH Gradients: IPG Strip Equilibration. CSH Protoc. , (2006).
- Azimzadeh, O., et al. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics. J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).
- Singh, S., et al. Identification of the p16-Arc subunit of the Arp 2/3 complex as a substrate of MAPK-activated protein kinase 2 by proteomic analysis. J Biol Chem. 278, 36410-36417 (2003).
- Rabilloud, T. Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis. 19, 758-760 (1998).
- Molloy, M. P., et al. Extraction of membrane proteins by differential solubilization for separation using two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 19, 837-844 (1998).
- Ericsson, C., Peredo, I., Nister, M. Optimized protein extraction from cryopreserved brain tissue samples. Acta Oncol. 46, 10-20 (2007).
- Shaw, M. M., Riederer, B. M. Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis. Proteomics. 3, 1408-1417 (2003).
- Ye, X., et al. Optimization of protein solubilization for the analysis of the CD14 human monocyte membrane proteome using LC-MS/MS. J Proteomics. 73, 112-122 (2009).
- Centlow, M., Hansson, S. R., Welinder, C. Differential proteome analysis of the preeclamptic placenta using optimized protein extraction. J Biomed Biotechnol. 2010, 458-748 (2010).
- Perdew, G. H., Schaup, H. W., Selivonchick, D. P. The use of a zwitterionic detergent in two-dimensional gel electrophoresis of trout liver microsomes. Anal Biochem. 135, 453-455 (1983).
- Schindowski, K., et al. Alzheimer’s disease-like tau neuropathology leads to memory deficits and loss of functional synapses in a novel mutated tau transgenic mouse without any motor deficits. Am J Pathol. 169, 599-616 (2006).
- Veenstra, T. D., Marcus, K. Multidimensional advancement of neuroproteomics. Expert Rev Proteomics. 5, 149-151 (2008).
- Hernandez-Hernandez, O., et al. Myotonic dystrophy CTG expansion affects synaptic vesicle proteins, neurotransmission and mouse. 136, 957-970 (2013).
- Deramecourt, V., et al. Biochemical staging of synucleinopathy and amyloid deposition in dementia with Lewy bodies. J Neuropathol Exp Neurol. 65, 278-288 (2006).
- Tofaris, G. K., Razzaq, A., Ghetti, B., Lilley, K. S., Spillantini, M. G. Ubiquitination of alpha-synuclein in Lewy bodies is a pathological event not associated with impairment of proteasome function. J Biol Chem. 278, 44405-44411 (2003).
- Sergeant, N., et al. Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer’s disease as new targets for the vaccination approach. J Neurochem. 85, 1581-1591 (2003).
- Le Freche, H., et al. Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment. Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).
- Leboucher, A., et al. Detrimental effects of diet-induced obesity on tau pathology are independent of insulin resistance in tau transgenic mice. Diabetes. 62, 1681-1688 (2013).
- Deramecourt, V., et al. Clinical, neuropathological, and biochemical characterization of the novel tau mutation P332S. J Alzheimers Dis. 31, 741-749 (2012).
- Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue. Cell Tissue Bank. 12, 311-318 (2011).
- Bell, J. E., et al. Management of a twenty-first century brain bank: experience in the BrainNet Europe consortium. Acta Neuropathol. 115, 497-507 (2008).
- Crecelius, A., et al. Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE. Proteomics. 8, 1276-1291 (2008).
- Swatton, J. E., Prabakaran, S., Karp, N. A., Lilley, K. S., Bahn, S. Protein profiling of human postmortem brain using 2-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2-D DIGE). Mol Psychiatry. 9, 128-143 (2004).
- Viswanathan, S., Unlu, M., Minden, J. S. Two-dimensional difference gel electrophoresis. Nat Protoc. 1, 1351-1358 (2006).
- Tannu, N. S., Hemby, S. E. Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis for comparative proteomics profiling. Nat Protoc. 1, 1732-1742 (2006).
