بروتين إجماع الدماغ المستمدة، بروتوكول استخراج لدراسة الإنسان والفئران بروتيوم الدماغ عن طريق كل من 2D-DIGE والبسيطة 2DE Immunoblotting
Summary
بروتوكول استخراج البروتين الشائعة باستخدام العازلة اليوريا / ثيوريا / SDS لأنسجة المخ الفئران والإنسان يسمح يفهم المرء من البروتينات عن طريق 2D-DIGE وتوصيف لاحقا من قبل 2DE صغيرة immunoblotting. هذه الطريقة تمكن واحد للحصول على نتائج أكثر استنساخه وموثوق بها من الخزعات الإنسان ونماذج تجريبية.
Abstract
ثنائي الأبعاد الكهربائي للهلام (2DE) هو أداة قوية للكشف عن تعديلات محتملة بروتيوم المتعلقة مختلفة ظروف فيزيولوجية أو مرضية. أساسا، ويستند هذا الأسلوب على فصل البروتينات وفقا لجهة نظرهم كهرساوي في الخطوة الأولى، وثانيا وفقا لأوزانها الجزيئية بواسطة SDS هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (SDS-PAGE). في هذا التقرير يوصف أمثل نموذج البروتوكول تمهيدا لكمية قليلة من بعد الوفاة والفأر الدماغ الأنسجة البشرية. تمكن هذه الطريقة لأداء كل من ثنائي الأبعاد الفرق مضان الكهربائي للهلام (2D-DIGE) و2DE صغيرة immunoblotting. مزيج من هذين النهجين يسمح احد لتجد ليس فقط البروتينات الجديدة و / أو التعديلات البروتين في التعبير عن شكرهم لتوافقه مع الكشف عن مطياف الكتلة، ولكن أيضا نظرة جديدة في التحقق من صحة علامات. وبالتالي، إلى جانب مصغرة 2DE لتصاريح النشاف الغربية لتحديد والتحقق من صحة آخرمتعدية التعديلات والبروتينات هدم ويوفر المقارنة بين نوعي الظروف و / أو علاجات مختلفة. هنا، ونحن نقدم طريقة لدراسة مكونات المجاميع البروتين الموجود في الجسم ليوي م والخرف مثل الببتيد اميلويد بيتا وألفا synuclein. يمكن بالتالي لدينا وسيلة يمكن تكييفها لتحليل بروتيوم واستخراج البروتينات غير قابلة للذوبان من أنسجة المخ والفئران النماذج البشرية أيضا. في موازاة ذلك، قد تقدم معلومات مفيدة لدراسة المسارات الجزيئية والخلوية تشارك في الأمراض العصبية وكذلك المؤشرات الحيوية المحتملة الرواية والأهداف العلاجية.
Introduction
الاضطرابات النفسية والعصبية تمثل 13٪ من عبء المرض العالمي، والتحديات الجديدة مثل الآليات المرضية في جسم المريض، وعوامل الخطر والمؤشرات الحيوية البادري يجب استكشافها 1. تمشيا مع هذا الهدف، البروتيوميات دراسات الدماغ البشري أصبحت لا غنى عنها للكشف عن المسارات الجزيئية المشاركة في العمليات مثل الذاكرة والسلوك والعواطف واللدونة العصبية على سبيل المثال، وليس فقط من أجل الفسيولوجية ولكن أيضا لظروف مرضية. ولذا، فإن استخدام نماذج حيوانية وبشكل أكثر تحديدا في الفئران المعدلة وراثيا، ويجلب طائفة واسعة من الاحتمالات لتقليد مسببات الاضطرابات العصبية البشرية 2.
وتتوفر في الوقت الحاضر النهج البروتينات من أجل تحقيق هذه الرؤى الجديدة في مجال علم الأعصاب. ثنائي الأبعاد الكهربائي هلام (2DE) هو وسيلة بسيطة وفعالة المرجح أن تمكن من مقارنة بروتيوم من مجموعة واسعة من العينات. علاوة على ذلك، وإنما هو أيضاطريقة قوية لعزل البروتين من خليط معقد من أجل تحديد ومواصلة تحليل بواسطة مطياف الكتلة. هذا الأسلوب يتكون أساسا في خطوتين متعاقبة: 1) فصل البروتين وفقا لنقطة تساوي الكهربية الخاصة بهم (PI) من خلال isoelectrofocusing (منتدى الطاقة الدولي). أكثر دقة، يتم تطبيق الجهد الكهربائي عبر شرائط الأكريلاميد immobiline بين التدرج درجة الحموضة ومن ثم سوف تهاجر البروتينات والتركيز على متزمت العزم في وظيفة مقابل صافي العالمية. 2) البروتينات ركزت Isoelectrically هي التشويه والتحريف، واتهم سلبا بإضافة الصوديوم كبريتات دوديسيل (SDS)، وبذلك يتم فصل البروتينات في أول بنيتها اعتمادا على ما يبدو على الوزن الجزيئي (MW) بواسطة SDS-PAGE 3. هذين خصائص متميزة تسمح لنا لمعالجة قيمة مضاعفة لتذهب أبعد من ذلك في دراسة بروتيوم. من ناحية هذا النهج يوفر إمكانية لإجراء التحليل الكمي باستخدام الحد الأدنى من الأصباغ طريقة 2D-DIGE، وعلى الجانب الآخر qualitativتحليل الإلكترونية بواسطة مصغرة 2DE جانب لالنشاف الغربية.
التحليل الكمي من قبل 2D-DIGE يمنح يغير البروتين التعبير في جميع أنحاء عينة بروتيوم. لفترة وجيزة، وصفت العينات مع ثلاثة cyanines (CY2، CY3 وCy5) الباعثة على ثلاثة أطوال موجية مميزة (الأزرق والأخضر والأحمر). هذه الأصباغ التي تحتوي على الحد الأدنى من فلوري-N هيدروكسي مجموعة succinimidyl استر تتفاعل مع المجموعة الأمينية-ε من lysines المخلفات الناتجة من البروتينات في السندات أميد التساهمية 4. وصفت بقايا يسين فقط بين 1-3٪ وبالتالي منع إضافة تسميات متعددة لكل من البروتين والتعديلات صافي تهمة الكبرى 5، 6. وغالبا ما تستخدم CY3 وCy5 لتسمية عينتين مستقلتين بينما العلامات CY2 مزيج من نسبة متساوية من العينات للمقارنة. المزايا الرئيسية هما أن جميع العينات وصفت مختلطة وتتم منتدى الطاقة الدولي وSDS-PAGE في هلام واحد في وقت واحد عن كل خطوة، وتجنب التباين بين بين التجارب بسبب المواد الهلامية المقارنة. وعلاوة على ذلك، فإنه يمثل عتبة الكشف عالية من حوالي 1 فيمتومول من البروتين 7. يتم فحص المواد الهلامية والبرمجيات 2D يقارن الصور مضان هلام 2D، حيث يخدم CY2 كمعيار داخلي يسمح لتحديد فروق ذات دلالة إحصائية بين البقع لتحديد الخلفي عن طريق قياس الطيف الكتلي. برنامج تحليل 2D باستخدام معيار الداخلية يحقق كشف سريع من أقل من 10٪ من الاختلافات بين العينات مع أكثر من 95٪ من الثقة الإحصائية 8.
التحليل النوعي من قبل مصغرة 2DE هو خطوة حاسمة لتوصيف البروتين. المبدأ هو نفسه كما هو موضح سابقا لPI وMW الانفصال، ولكن في هذه الحالة يتم نقل البروتينات من هلام بولي أكريلاميد صغيرة إلى الغشاء ويتم تنفيذ immunoblotting بعد ذلك. بينما احدة الكهربائي هلام البعد يوفر التغيرات في تعبير البروتين واحد أو عدة الحواتم البروتين في وظيفة من الأجسام المضادة، والمعلومات!ن مصغرة 2DE يمنح مع معلمتين إضافية. أولا، تغيير isovariants البروتين في وظيفة من المعهد البترولي، مشيرا إلى أن التعديلات بعد متعدية قد يتحقق. ثانيا، قد يكون تحديد قياس الطيف الكتلي يدل على zymogens المعقول والمنتجات تقويضي للبروتينات. لذلك، تعديلات لاحظها 2D-DIGE من المرجح يدل على الآليات الكامنة وراء التغييرات في التشكيل بروتيوم العالمية. قد يعكس التحالفات من immunoblots بين عدة عينات لنفس البروتين حاتمة / ثانية عن طريق مصغرة 2DE التغييرات الحموضة تسليط الضوء على الاختلافات آخر متعدية لوحظ قليلا أو حتى ليس من immunoblotting monodimensional 9، 10. وعلاوة على ذلك، فإن هذا التحليل بإعلام حول المواقع المحتملة بسبب الانقسام معرفة PI وميجاوات من مخلفات التمثيل الغذائي 11،12.
مزيج من هذه التقنيات اثنين يوفر تحليل البروتينات التكميلية. من جهة 2D-DIGE يتيح لالطباع(ه) من الاختلافات السماح عزلة الدقيق للالبروتينية التي التعبير مختلفة. هذه الاختلافات تتكون أساسا إلى ظهور أو اختفاء بقعة أو زيادة / نقصان كثافة واحدة تعطى عن طريق تحليل البرمجيات من المواد الهلامية الفلورسنت. ومع ذلك، هذه الملاحظات من قبل أنفسهم من غير المحتمل أن يفسر طبيعة التعديل ملاحظتها. لهذه الأسباب، وبمجرد عزل ببتيد والتي حددها مطياف الكتلة، واستخدام مصغرة 2DE تمكن من تأكيد على وجه التحديد 1) هوية البروتين معزولة و2) طبيعة الفرق: تغيير في مستوى isovariant / الإسوي من التعبير، والتعديلات اللاحقة لمتعدية وعمليات الانقسام على سبيل المثال. ومع ذلك، فمن الضروري وضع بدء تحلل العازلة على حد سواء متوافقة مع 2D-DIGE ومع مصغرة 2DE من أجل الحد من التفرق المحتملة الناتجة عن استخدام بروتوكولات الاستخراج التي هي متباينة جدا.
في هذه المادة، ونحن ديمكتوب بروتوكول تكييفها لإعداد واستخراج وأداء 2D-DIGE والتقنيات المصغرة 2DE للبروتينات الدماغ قادمة من الأنسجة البشرية والفأرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
اكتشاف التغيرات المرضية التعبير من البروتينات، والبحث عن المؤشرات الحيوية والتشكيل من المسارات المحتملة للأهداف الدوائية هي من بين أهداف neuroproteomics النهج 30. وسط الأدوات الناشئة، مجال 2DE يضيف expectative واعدة. ومع ذلك، ينبغي التوصل إلى توافق في الآراء من أجل تقليل ال?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل INSERM، جامعة ليل 2، MEDIALZ، LabEx (مختبر الامتياز، برنامج استثمار للمستقبل) وDISTALZ (تطوير استراتيجيات مبتكرة لنهج العبرمناهجية لمرض الزهايمر). FJ.FG حاليا زمالة المستفيد من وكالة الاستخبارات الوطنية (وكالة الأبحاث الوطنية الفرنسية / NeuroSplice دي تاو PROJET ANR-2010-1114-بلان 01)، ولكن هذا العمل أيضا في ظل دعم من منحة من JCCM (إسبانيا).
Materials
| CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5nmol 1 * 5 Nmo | GE Healtcare | 25-8010-65 | |
| Immobiline DryStrip | GE Healtcare | Reference in function of the pH interval/size | |
| IPG Buffer, pH X-X | GE Healtcare | Reference in function of the pH interval desired | |
| AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1 | GE Healtcare | 551797N | |
| DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l | GE Healtcare | 17-1335-01 | |
| KIT BOX IPG 1 * 1 KIT | GE Healtcare | 28-9334-92 | Plastic box to make the passive rehydration |
| MILLEX GS Filter | Millipore | SLGS033SB | |
| Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L) | Bio-Rad | Reference in function of the MW to separate | |
| IPGphor III Isoelectric Focusing Unit | GE Healtcare | 11-0033-64 | |
| Ettan DALTsix Large Electrophoresis System | GE Healtcare | 80-6485-08 | |
| OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm | Gel Company | P2D1.5 |
Referencias
- Collins, P. Y., et al. Grand challenges in global mental health. Nature. 475, 27-30 (2011).
- De Deyn, P. P., Van Dam, D., Sergeant, N., Buée, L. . Animal Models of Dementia Vol. 48 Neuromethods 449-468. , 449-468 (2011).
- O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem. 250, 4007-4021 (1975).
- Riederer, B. M. Non-covalent and covalent protein labeling in two-dimensional gel electrophoresis. J Proteomics. 71, 231-244 (2008).
- Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382, 669-678 (2005).
- Westermeier, R., Scheibe, B. Difference gel electrophoresis based on lys/cys tagging. Methods Mol Biol. 424, 73-85 (2008).
- Gong, L., et al. Drosophila ventral furrow morphogenesis: a proteomic analysis. Development. 131, 643-656 (2004).
- Gharbi, S., et al. Evaluation of two-dimensional differential gel electrophoresis for proteomic expression analysis of a model breast cancer cell system. Mol Cell Proteomics. 1, 91-98 (2002).
- Ando, K., et al. Tau pathology modulates Pin1 post-translational modifications and may be relevant as biomarker. Neurobiol Aging. 34, 757-769 (2013).
- Bretteville, A., et al. Two-dimensional electrophoresis of tau mutants reveals specific phosphorylation pattern likely linked to early tau conformational changes. PLoS One. 4, 4843 (2009).
- Sergeant, N., et al. Two-dimensional characterization of paired helical filament-tau from Alzheimer’s disease: demonstration of an additional 74-kDa component and age-related biochemical modifications. J Neurochem. 69, 834-844 (1997).
- Sergeant, N., et al. Different distribution of phosphorylated tau protein isoforms in Alzheimer’s and Pick’s diseases. FEBS Lett. 412, 578-582 (1997).
- Rabilloud, T., Luche, S., Santoni, V., Chevallet, M. Detergents and chaotropes for protein solubilization before two-dimensional electrophoresis. Methods Mol Biol. 355, 111-119 (2007).
- Wrobel, K., Caruso, J. A. Pretreatment procedures for characterization of arsenic and selenium species in complex samples utilizing coupled techniques with mass spectrometric detection. Anal Bioanal Chem. 381, 317-331 (2005).
- McCarthy, J., et al. Carbamylation of proteins in 2-D electrophoresis–myth or reality. J Proteome Res. 2, 239-242 (2003).
- Chafey, P., et al. Proteomic analysis of beta-catenin activation in mouse liver by DIGE analysis identifies glucose metabolism as a new target of the Wnt pathway. Proteomics. 9, 3889-3900 (2009).
- Kahn, J. E., et al. Comparative proteomic analysis of blood eosinophils reveals redox signaling modifications in patients with FIP1L1-PDGFRA-associated chronic eosinophilic leukemia. J Proteome Res. 10, 1468-1480 (2011).
- Pottiez, G., et al. A large-scale electrophoresis- and chromatography-based determination of gene expression profiles in bovine brain capillary endothelial cells after the re-induction of blood-brain barrier properties. Proteome Sci. 8, 57 (2010).
- Stochaj, W. R., Berkelman, T., Laird, N. Preparative 2D Gel Electrophoresis with Immobilized pH Gradients: IPG Strip Equilibration. CSH Protoc. , (2006).
- Azimzadeh, O., et al. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics. J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).
- Singh, S., et al. Identification of the p16-Arc subunit of the Arp 2/3 complex as a substrate of MAPK-activated protein kinase 2 by proteomic analysis. J Biol Chem. 278, 36410-36417 (2003).
- Rabilloud, T. Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis. 19, 758-760 (1998).
- Molloy, M. P., et al. Extraction of membrane proteins by differential solubilization for separation using two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 19, 837-844 (1998).
- Ericsson, C., Peredo, I., Nister, M. Optimized protein extraction from cryopreserved brain tissue samples. Acta Oncol. 46, 10-20 (2007).
- Shaw, M. M., Riederer, B. M. Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis. Proteomics. 3, 1408-1417 (2003).
- Ye, X., et al. Optimization of protein solubilization for the analysis of the CD14 human monocyte membrane proteome using LC-MS/MS. J Proteomics. 73, 112-122 (2009).
- Centlow, M., Hansson, S. R., Welinder, C. Differential proteome analysis of the preeclamptic placenta using optimized protein extraction. J Biomed Biotechnol. 2010, 458-748 (2010).
- Perdew, G. H., Schaup, H. W., Selivonchick, D. P. The use of a zwitterionic detergent in two-dimensional gel electrophoresis of trout liver microsomes. Anal Biochem. 135, 453-455 (1983).
- Schindowski, K., et al. Alzheimer’s disease-like tau neuropathology leads to memory deficits and loss of functional synapses in a novel mutated tau transgenic mouse without any motor deficits. Am J Pathol. 169, 599-616 (2006).
- Veenstra, T. D., Marcus, K. Multidimensional advancement of neuroproteomics. Expert Rev Proteomics. 5, 149-151 (2008).
- Hernandez-Hernandez, O., et al. Myotonic dystrophy CTG expansion affects synaptic vesicle proteins, neurotransmission and mouse. 136, 957-970 (2013).
- Deramecourt, V., et al. Biochemical staging of synucleinopathy and amyloid deposition in dementia with Lewy bodies. J Neuropathol Exp Neurol. 65, 278-288 (2006).
- Tofaris, G. K., Razzaq, A., Ghetti, B., Lilley, K. S., Spillantini, M. G. Ubiquitination of alpha-synuclein in Lewy bodies is a pathological event not associated with impairment of proteasome function. J Biol Chem. 278, 44405-44411 (2003).
- Sergeant, N., et al. Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer’s disease as new targets for the vaccination approach. J Neurochem. 85, 1581-1591 (2003).
- Le Freche, H., et al. Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment. Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).
- Leboucher, A., et al. Detrimental effects of diet-induced obesity on tau pathology are independent of insulin resistance in tau transgenic mice. Diabetes. 62, 1681-1688 (2013).
- Deramecourt, V., et al. Clinical, neuropathological, and biochemical characterization of the novel tau mutation P332S. J Alzheimers Dis. 31, 741-749 (2012).
- Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue. Cell Tissue Bank. 12, 311-318 (2011).
- Bell, J. E., et al. Management of a twenty-first century brain bank: experience in the BrainNet Europe consortium. Acta Neuropathol. 115, 497-507 (2008).
- Crecelius, A., et al. Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE. Proteomics. 8, 1276-1291 (2008).
- Swatton, J. E., Prabakaran, S., Karp, N. A., Lilley, K. S., Bahn, S. Protein profiling of human postmortem brain using 2-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2-D DIGE). Mol Psychiatry. 9, 128-143 (2004).
- Viswanathan, S., Unlu, M., Minden, J. S. Two-dimensional difference gel electrophoresis. Nat Protoc. 1, 1351-1358 (2006).
- Tannu, N. S., Hemby, S. E. Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis for comparative proteomics profiling. Nat Protoc. 1, 1732-1742 (2006).
